研究背景与研究目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在糖尿病患者中的患病率大约为20%～40%,是糖尿病的重要并发症和主要死亡原因。近年来随着糖尿病患者人数的快速增长,DN的发病率逐年上升,在一些国家或地区已经成为终末期肾病(ESRD)的首位原因。DN的发病机制极为复杂,其确切机制尚未明确,多种因素通过各自作用以及相互交叉作用共同导致DN的发生和发展。对DN发病机制更深一步的研究,将对发掘DN有效的预防和治疗方法产生深远而重要的意义。足细胞是肾小球滤过膜极其重要的组成部分,其电荷屏障作用是阻止蛋白质漏出的关键。DN时足细胞发生EMT,足突融合、消失,随后发生阴离子电荷减少、微绒毛形成、体积缩小,足细胞最终从肾小球基底膜(GBM)上分离剥脱至肾小囊中,发生足细胞分离。通常认为足细胞EMT是足细胞损伤的起始环节,可以导致足细胞运动性增强、蛋白尿和肾小球纤维化。在EMT的过程中,足细胞标志物synaptopodin、紧密连接蛋白-1(zonula occludens,ZO-1)、P-cadherin 和nephrin降低,间质细胞标志物胶原蛋白-1、纤连蛋白(fibronectin,FN)、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1,FSP-1)以及 α-平滑肌激动蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)升高。尽管传统观点认为DN是继发性肾小球疾病,现在越来越多的证据表明肾功能损伤的程度与肾小管间质纤维化的程度更加相关,肾小管损伤在DN进展中作用不容忽视。在肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells,TECs)EMT的过程中,上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1降低,间质细胞标志物FN、collagen-1、α-SMA、FSP-1 升高。Snail、Zeb 和 helix loop helix(HLH)家族都是引发EMT的重要转录因子,它们能够抑制E-cadherin的表达并促进间质细胞标志物的表达。血清反应因子(serum response factor,SRF)是高度保守的顺式作用因子,属于MADS-box转录因子家族。与SRF结合的DNA位点为血清反应元件(Serum response element,SRE),存在于几乎所有物种的基因组中,控制着细胞骨架和收缩蛋白的表达。SRF促进中胚层细胞迁移,在胚胎体轴延长中发挥重要作用,表明SRF对胚胎发育至关重要。根据目的基因的不同,SRF可以通过两条途径被激活(见图1):Ras-细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)-三重复合物因子(ternary complex factors,TCFs);Rho-肌动蛋白-心肌蛋白相关转录因子(myocardin related transcription factors,MRTFs/MAL)。大量研究表明SRF在上皮肿瘤(如肝细胞癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等)的EMT和转移过程中发挥重要作用。在转基因小鼠,过表达的SRF可以导致肌细胞肥大、间质纤维化和肌纤维损伤。相反的,SRF冠状动脉平滑肌细胞敲除可以降低血管平滑肌细胞的迁移和增殖能力。此外,SRF促进转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)介导的肺肌成纤维细胞分化,应用蛋白激酶A降低SRF的表达和活性可以抑制这一作用。近期王汉民等研究表明,SRF在大鼠单侧输尿管结扎模型中可导致肾小管上皮细胞EMT;SRF通过snail信号转导通路加重高糖透析液引起的腹膜间皮细胞EMT。根据以上背景,我们提出如下假说:在高血糖情况下,大鼠肾脏中SRF和磷酸化SRF(pSRF)表达升高,并且从细胞质向细胞核转位增加,通过Snail信号转导通路导致足细胞和肾小管上皮细胞EMT,加重肾脏纤维化和蛋白尿;小分子抑制剂CCG-1423可以直接抑制SRF和pSRF的表达,减轻足细胞和肾小管上皮细胞EMT,改善糖尿病大鼠的肾脏纤维化和蛋白尿。为了验证此假说,我们通过1型糖尿病大鼠模型和体外培养永生化足细胞、近端小管上皮细胞,分别探讨SRF在DN肾小球纤维化和肾小管间质纤维化中的作用及相关机制,从而发掘DN新的治疗靶点。研究方法为了明确SRF在DN肾小球纤维化中的作用及相关机制,体外实验采用小鼠永生化足细胞,CCG-1423(1 uM或2μM)预处理1h后,进行高糖刺激72h;为了探索SRF是否促进足细胞EMT,我们采用SRF上调质粒转染足细胞,并使用Transwell小室迁移分析评估足细胞的迁移能力。体内实验采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)构建糖尿病大鼠模型,STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW),持续8周。实验结束前对大鼠称重并放入代谢笼收取24h尿,然后抽血、灌流、取肾,随后检测和计算各项指标。采用western blot、实时荧光定量PCR(QPCR)和半定量PCR方法检测小鼠足细胞和大鼠肾皮质SRF、pSRF、synaptopodin、ZO-1、collagen-1、α-SMA 和 FSP-1 等的表达;免疫荧光染色检测足细胞中SRF的表达量和定位;实验室方法检测大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫组织化学染色(免疫组化)方法检测大鼠肾小球中SRF、P-cadherin、FN等的表达;PAS染色和masson染色评估大鼠肾小球纤维化的程度。为了明确SRF在DN肾小管间质纤维化中的作用及相关机制,体外实验采用永生化人近端小管上皮细胞(HK-2细胞),CCG-1423(1μM or 2μM)预处理1h后,进行高糖刺激72h;为了探索SRF是否促进HK-2细胞EMT,我们采用SRF上调质粒转染HK-2细胞,并使用Transwell小室迁移分析评估HK-2细胞的迁移能力。体内实验采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)构建糖尿病大鼠模型,STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW),持续8周。实验结束前对大鼠称重并放入代谢笼收取24h尿,然后抽血、灌流、取肾,随后检测和计算各项指标。采用western blot和QPCR方法检测大鼠肾髓质和HK-2细胞SRF、pSRF、E-cadherin、ZO-1、collagen-1、α-SMA 和 FSP-1 等的表达;免疫荧光染色检测HK-2细胞中SRF的表达量和定位;实验室方法检测大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫组化方法检测大鼠肾髓质中SRF、E-cadherin、FN等的表达;PAS染色评估大鼠肾小管间质纤维化的程度。研究结果1.SRF在DN足细胞EMT中的作用及相关机制1.1高糖刺激导致足细胞EMT和SRF表达升高与正常组和甘露醇对照组相比,高糖刺激72h后,足细胞中SRF和pSRF的蛋白表达和基因表达均明显升高,足细胞标志物(synaptopodin、ZO-1)表达明显下降,间质细胞标志物(collagen-1,FN,FSP-1和α-SMA)表达明显升高。免疫荧光染色显示,高糖不仅导致SRF表达升高,而且诱导SRF向足细胞核内转移。1.2在足细胞中过表达SRF,导致EMT和肾小球滤过膜损伤与转染空白质粒(pcDNA3.1)的足细胞相比,转染SRF上调质粒(pcDNA-SRF)的足细胞中 synaptopodin 表达下降,collagen-1、FN、FSP-1、α-SMA 和 Snail表达升高。在Transwell小室迁移分析中,pcDNA-SRF组迁移数量较pcDNA 3.1组明显增加。在白蛋白滤过实验中,pcDNA-SRF组白蛋白滤过量较pcDNA 3.1组明显升高。1.3 CCG-1423对高糖诱导的足细胞EMT的作用与高糖组相比,经CCG-1423预处理的足细胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表达和基因表达均降低,synaptopodin表达升高,collagen-1、FN、FSP-1和α-SMA表达降低。免疫荧光染色显示,CCG-1423不仅可以降低SRF的表达,而且还能抑制SRF向足细胞核内转移,从而进一步抑制SRF的作用。1.4糖尿病大鼠肾皮质中SRF的变化随着糖尿病时间的延长,大鼠肾皮质中SRF的蛋白表达和基因表达均逐渐升高。免疫组化表明,随着糖尿病病程的延长,肾小球中SRF的表达较正常组逐渐升高。1.5 CCG-1423对糖尿病大鼠生化指标的影响与正常组相比,DM组血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和肾重体重比升高,血清自蛋白降低,所有糖尿病大鼠造模成功。与DM组相比,CCG-1423治疗后的糖尿病大鼠血清白蛋白明显升高,但是血糖、血肌酐、血尿素氮和肾重体重比没有变化。1.6 CCG-1423对糖尿病大鼠肾小球纤维化和蛋白尿的影响与DM组相比,CCG-1423治疗后糖尿病大鼠24h尿蛋白定量降低约500%,肾皮质SRF、pSRF、collagen-1、FSP-1表达量明显降低,synaptopodin表达量明显升高。免疫组化显示,与DM组相比,DM+CCG-1423组肾小球α-SMA和FN的表达降低,P-cadherin表达升高。Masson染色和PAS染色均表明,CCG-1423可以使糖尿病大鼠的肾小球纤维化程度明显减轻,肾小球硬化指数降低约500%。2.SRF在DN肾小管上皮细胞EMT中的作用及相关机制2.1高糖刺激导致HK-2细胞EMT和SRF表达升高与正常组和甘露醇对照组相比,高糖刺激72h后,HK-2细胞中SRF和pSRF的蛋白表达和基因表达均明显升高,上皮细胞标志物(E-cadherin和ZO-1)表达明显下降,间质细胞标志物(collagen-1,FN,α-SMA和FSP-1)表达明显升高。免疫荧光染色显示,高糖不仅导致SRF表达升高,而且诱导SRF向HK-2细胞核内转移,从而发挥调节转录的作用。2.2在HK-2细胞中过表达SRF导致EMT与正常组和pcDNA 3.1组相比,转染SRF上调质粒(pcDNA-SRF)的HK-2细胞中 E-cadherin 表达下降,collagen-1、FN、α-SMA、FSP-1 和 Snail 表达升高。在Transwell小室迁移分析中,pcDNA-SRF组迁移细胞数量较正常组和pcDNA 3.1组明显增加。2.3 CCG-1423对高糖诱导的HK-2细胞EMT的作用与高糖组相比,经CCG-1423预处理的HK-2细胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表达和基因表达均降低,E-cadherin表达升高,collagen-1、FN、α-SMA和FSP-1表达降低。免疫荧光染色显示,CCG-1423不仅可以降低SRF的表达,而且还能抑制SRF向HK-2细胞核内转移,从而进一步抑制SRF的作用。2.4糖尿病大鼠生化指标的变化与正常组相比,随着糖尿病时间的延长,大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和肾重体重比均逐渐升高,血清白蛋白逐渐降低,实验组所有糖尿病大鼠造模成功。2.5糖尿病大鼠肾髓质中SRF的变化随着糖尿病时间的延长,大鼠肾髓质中SRF的蛋白表达和基因表达均逐渐升高。免疫组化表明,随着糖尿病病程的延长,肾小管中SRF的表达较正常组逐渐升高。2.6 CCG-1423对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化和白蛋白尿的影响与DM组相比,CCG-1423治疗后糖尿病大鼠肾髓质SRF、pSRF、collagen-1、α-SMA、FSP-1和Snail表达量明显降低,E-cadherin表达量明显升高,24h尿白蛋白定量降低约36.4%。免疫组化显示,与DM组相比,DM+CCG-1423组肾小管FN、FSP-1和Snail表达降低,E-cadherin表达升高。PAS染色表明,CCG-1423可以使糖尿病大鼠的肾小管间质纤维化程度明显减轻。结论1.高血糖激活大鼠肾脏中SRF,使SRF和pSRF表达升高,并且从细胞质向细胞核转移增加,通过Snail信号转导通路导致足细胞和肾小管上皮细胞EMT,导致蛋白尿、肾小球纤维化和肾小管间质纤维化。2.使用CCG-1423抑制SRF,可以使足细胞和肾小管上皮细胞EMT减轻,丢失减少,保护肾小球和肾小管的功能。3.使用CCG-1423抑制SRF,可以减轻DN的肾小球纤维化和肾小管间质纤维化,降低蛋白尿,升高血清白蛋白,延缓DN的进展,有望成为DN的有效治疗方法。