目的:　　通过微生物遗传学、生物化学与分子生物学等分析手段系统的研究，能够阐述Cu2+在厌氧条件下对铁硫簇组装的影响以及Cu2+对大肠杆菌毒性比在有氧条件下增大的机制，从而为铁硫簇组装机制和铜的杀菌机制研究奠定了重要的理论基础。　　方法:　　1. 厌氧条件下铜离子毒性增大的验证及铜离子实验浓度的选定。　　1)Cu2+实验浓度的选定　　配制不同Cu2+浓度的LB平板，在平板上滴加OD600=0.05的菌液，分别放在有氧和厌氧条件下37℃培养24小时，观察菌落状态及大小，初步验证厌氧条件下Cu2+毒性的增加及得到适合实验的Cu2+浓度。　　2)生长曲线的绘制　　在有氧和厌氧条件下通过终点法测定大肠杆菌在不同Cu2+浓度LB液体培养基中的生长曲线，将有氧和厌氧条件下Cu2+对细菌生长的影响量化，并得到实验Cu2+浓度。　　2. 厌氧条件下Cu2+对多种铁硫簇组装影响的的验证。　　2.1 [4Fe-4S]蛋白IlvD的表达，纯化及活性测定　　1)设置四种实验环境，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厌氧不加Cu2+，厌氧加200μM Cu2+。在四种条件下进行IlvD的表达。蛋白质经Ni柱亲和纯化。纯化后的蛋白用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描分析，并进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE电泳分析。　　2)蛋白铁、硫、铜含量的测定　　A.采用菲咯嗪法测定蛋白中的铁含量:在L-cysteine的作用下，蛋白样品中的铁释放出来并与菲咯嗪(Ferrozine)结合形成Fe-Ferrozine络合物，在564 nm处具有特征性吸收峰，其消光系数为27.9 mM-1cm-1，利用公式CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9(单位:μM)求得铁含量。　　B.采用DPD法测定蛋白中的硫含量:硫化物与FeCl3相互作用，DPD(Ndiethyl-p-phenylenediamie)作为显色剂，可在669 nm处形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系数即可算得蛋白中的硫含量。由于硫的消光系数不稳定，以Nth（一种稳定的[4Fe-4S]蛋白）为阳性对照，用Nth计算硫的消光系数。根据公式计算硫含量: CS=(OD669-OD800)*1000/S消光系数(单位:μM)S消光系数=(OD669-OD800)*1000/Nth CSNth CS=Nth CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9　　C.铜含量测定参考Tutem的方法进行改进，160μL蛋白与10μL5 mMneocuproine（溶解在50％无水乙醇中）、20μL20％ SDS和10μL5 mM维生素C混合，室温孵育30 min，离心，取上清测定。其在450 nm处具有特征性吸收峰，其消光系数为8.1 mM-1cm-1，利用公式CCu=(OD450-OD700)*1000/8.1（单位:μM）求得铜含量。　　3)IlvD（二羟酸脱水酶）活性测定。　　原理是IlvD催化底物D，L-2，3-二羟基-异戊酸产生具有240 nm吸收峰的产物(酮酸，消光系数为0.19 mM-1cm-1)，利用分光光度计检测240 nm来反映产物的生成量，从而计算IlvD酶的活性。具体方法是取纯化后的IlvD10-20μL迅速加入含有50 mM Tris(pH8.0)、10 mM MgCl2和10mM底物的反应液中，37℃反应并监测240 nm的吸光度2 min，通过计算2 min内新生产物的生成量来得到IlvD的酶活力。　　2.2 [4Fe-4S]蛋白Nth和[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW四种条件下的表达纯化及全波长扫描分析，并进行SDS-PAGE电泳分析和铁、硫、铜含量的测定。　　3. 厌氧条件下Cu2+对铁硫簇组装影响方式的研究。　　在铁硫蛋白表达前加Cu2+处理，铁硫蛋白表达后洗去诱导剂然后再加铜处理。分别纯化蛋白，纯化后的蛋白进行全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铁，硫，铜含量的测定。　　4. 厌氧条件下Cu2+对在iscA突变菌和iscU突变菌中表达的Nth的影响。在iscA突变菌，iscU突变菌中表达纯化Nth蛋白，分四个实验条件，有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厌氧不加Cu2+，厌氧加200μM Cu2+。表达纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及铁、硫、铜含量的测定。　　5. 厌氧条件下Cu2+对IscA蛋白，IscU蛋白和IscS蛋白的影响。　　5.1 IscA在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厌氧不加Cu2+，厌氧加200μMCu2+条件下的表达纯化，全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铁、硫、铜含量的测定。　　5.2 IscU在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厌氧不加Cu2+，厌氧加200μMCu2+条件下的表达纯化，全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铜含量的测定。　　5.3 IscS在有氧不加Cu2+，有氧加200μM Cu2+，厌氧不加Cu2+，厌氧加200μMCu2+条件下的表达纯化，全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及IscS活性测定。将纯化的IscS与L-cysteine、DTT在37℃条件下进行孵育， IscS可催化底物L-cysteine脱硫，在DTT存在的条件下形成H2S，H2S与FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作为显色剂，可在669 nm处形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系数即可算得蛋白中的硫含量，硫含量的多少可以直接反映IscS活性的大小。　　6. 厌氧条件下IscA蛋白和IscU蛋白体内铜离子梯度结合研究。　　在厌氧条件下设置不同浓度的铜离子梯度(0μM，50μM，100μM，200μM)，进行IscA和IscU蛋白的表达和纯化，纯化后的蛋白进行全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铁，硫，铜含量的测定。　　7. 厌氧条件下IscA蛋白和IscU蛋白体外铜离子梯度结合研究。　　7.1 在M9培养基中表达纯化IscA，制备apo-IscA蛋白。在体外条件下设置铜离子梯度(0μM，25μM，50μM，100μM，200μM，300μM)，加入25μMBSA，25μM apo-IscA，2 mM DTT分别在有氧和厌氧环境下处理30min，并进行重新纯化，纯化后的蛋白进行全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铜含量的测定。　　7.2 在LB培养基中表达纯化IscU，制备apo-IscU蛋白。在体外条件下设置不同浓度的铜离子梯度(0μM，100μM，200μM，400μM，600μM，800μM)，加入25μM BSA，25μM apo-IscU，2 mM DTT分别在有氧和厌氧环境下处理30 min，重新纯化，纯化后的蛋白进行全波长扫描分析，SDS-PAGE电泳分析以及铜含量的测定。　　结果:　　1. 平板37℃生长24h取出后，在有氧状态下，观察到野生MC4100在2 mM铜离子浓度下，菌落状态仍然正常。在厌氧条件下，200μM铜离子处理后菌落状态仍然正常，500μM处理后菌落若隐若现。通过平板实验看出厌氧条件下相同浓度的Cu2+对细菌生长产生了更大的影响。初步选取了200μM Cu2+浓度为实验浓度。在进一步的生长曲线实验发现，200μM Cu2+浓度在厌氧条件下对细菌生长影响不大，抑制了仅有20％。　　2. 纯化后的[4Fe-4S]蛋白Nth（核酸内切酶Ⅲ）和IlvD（二羟酸脱水酶），[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW进行全波长扫描结果发现，同样加200μM Cu2+，LB中诱导表达的[4Fe-4S]蛋白Nth和IlvD在厌氧条件下其铁硫簇的吸收峰(419nm)明显下降，对纯化后蛋白铁、硫含量测定及对IlvD进一步活性测验也显示同样的结果。而[2Fe-2S]蛋白FhuF和YeaW却没有明显下降。纯化后蛋白铁、硫含量测定也没有发生明显改变，初步得出结论:厌氧条件下200μM Cu2+对[4Fe-4S]蛋白毒性显著增强。　　3. 在四个实验条件下分别从iscA突变菌，iscU突变菌和野生MC4100中纯化出Nth蛋白，通过全波长扫描发现同样加200μM Cu2+在iscA突变菌和iscU突变菌中表达纯化的Nth蛋白其铁硫簇的吸收峰(419 nm)几乎消失，对蛋白的铁、硫含量的测定也证实了该结果。　　4. 在先加铜处理后诱导表达Nth蛋白及先诱导表达Nth蛋白后再加铜处理的实验中，通过全波长扫描发现，先加铜后诱导表达的Nth蛋白其铁硫簇的吸收峰(419nm)明显下降，而诱导表达后再加铜的Nth蛋白其铁硫簇的吸收峰(419nm)没有明显改变。说明了厌氧条件下Cu2+对[4Fe-4S]产生的毒性是影响了铁硫蛋白合成的通路，而不是对已经合成的[4Fe-4S]蛋白产生毒性。　　5. 铁硫簇组装通路中的IscA，IscU和IscS（半胱氨酸脱硫酶）蛋白的全波长扫描发现IscA，IscU蛋白在厌氧条件下加200μM Cu2+，其Cu2+结合峰(258nm)明显升高，通过对蛋白铜含量的测定也显示同样结果。而IscS没有变化，其活性测定也显示没有影响。　　6. 厌氧条件下，在LB中添加不同浓度的铜离子（0μM，50μM，100μM，200μM）表达IscA和IscU蛋白并纯化，对纯化后的蛋白进行全波长扫描分析其Cu2+结合峰(258 nm)逐渐升高，铜结合量也是逐渐升高。　　7. apo-IscA和apo-IscU蛋白在体外铜离子梯度处理后，重新纯化，重新纯化后的IscA和IscU蛋白经过Cu含量测定，有氧条件下，显示IscA在加入200μM铜离子后曲线渐平，说明其铜离子结合量趋于饱和，每个IscA结合约2个铜。厌氧条件下在加入50μM铜离子后曲线就开始平缓，铜离子结合量趋于饱和，每个IscA结合约2个铜。IscU有氧条件下在加入400μM铜离子后曲线渐平，说明其铜离子结合量趋于饱和接近于每个蛋白结合1个铜。厌氧条件下在加入800μM铜离子后曲线仍然上升。　　结论:　　1. MC4100和Ecoii CusA-CopA-CueO-/MC4100在厌氧条件下对铜离子的敏感度都比有氧条件下对铜离子的敏感高。其中MC4100有氧条件下Cu2+浓度在2 mM时菌落仍然正常，但是在厌氧条件下500μM时细菌生长就已经完全抑制。　　2. 厌氧条件下铜离子对铁硫簇的影响只体现在[4Fe-4S]铁硫簇的组装，而不影响[2Fe-2S]铁硫簇的组装。　　3. 厌氧条件下铜能够有效的抑制LB培养基生长的E.coli中[4Fe-4S]铁硫簇的组装，但对已经组装好的铁硫簇没有明显的影响。　　4. 厌氧条件下，在野生菌MC4100和iscA突变菌和iscU突变菌中各加200μM铜诱导表达出的Nth影响相差很大，在iscA突变菌和iscU突变菌中铁硫簇结合峰基本消失。　　5. 厌氧加200μM铜时，IscA蛋白和IscU蛋白结合了比有氧相同条件下更多的铜。