论文部分内容阅读
目的:本项目拟制备物理交联壳聚糖-甘油磷酸温敏水凝胶(CS/α,β-GP)负载含有骨形态发生蛋白2质粒DNA的壳聚糖纳米粒CSn(pDNA-BMP2),将其与CS/α,β-GP温敏水凝胶复合,构建CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合修复体系。研究该体系对人牙周成纤维细胞(HPDLCs)的细胞相容性。方法:一、载BMP2质粒DNA的壳聚糖纳米粒(CSn(pDNA-BMP2))的制备及性质检测:成功构建pDNA-BMP2质粒表达载体;采用离子交联法制备载BMP2质粒DNA壳聚糖纳米粒CSn(pDNA-BMP2);采用扫描电镜观察形态;zeta电位仪测定粒径、分散度、Zeta电位;应用琼脂凝胶阻滞法分析CSn载体与pDNA-BMP2的结合能力及电荷性质;运用酶保护法测定CSn载体对pDNA-BMP2的保护作用。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP体系的构建及性质检测:(1)CS/α,β-GP温敏水凝胶的制备:采用物理交联的方法制备CS/α,β-GP温敏水凝胶;扫描电镜下观察其微观形态;试管倒置法测定其温敏性。(2)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP体系的构建:取适量的CSn(pDNA-BMP2)磁力搅拌下分散于CS/α,β-GP温敏水凝胶溶液中,构建载CSn(pDNA-BMP2)的CS/α,β-GP温敏水凝胶体系,即CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系;扫描电镜下观察其微观形态;试管倒置法测定其温敏性。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP对HPDLCs细胞相容性的评价:(1)原代培养HPDLCs,并鉴定组织来源。(2)HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系中三维培养,观察细胞形态及增殖情况。(3)将HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系浸提液中培养,CCK8法检测细胞增殖情况;采用SPSS18.0统计软件处理所得数据。结果:一、CSn(pDNA-BMP2)的制备及性质检测结果:(1)空白CSn及CSn(pDNA-BMP2)电镜下观察,呈球形,粒径均一;CSn(pDNA-BMP2)粒径较空白CSn略大。(2)CSn的平均粒径为170nm,PDI为0.249,Zeta电位为45.5mv。CSn(pDNA-BMP2)平均粒径为270.1nm,PDI为0.486,Zeta电位为27.0mv。(3)琼脂凝胶电泳分析显示,由于中和了质粒DNA所带的负电荷,电泳时质粒不出孔,而裸质粒pDNA-BMP2出孔,证明CSn能有效地结合pDNA-BMP2;(4)酶保护实验显示,裸质粒pDNA-BMP2及N/P为0.5:1的孔内显示空白无条带,而CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1时,则仍为白色。证明CSn(pDNA-BMP2)在N/P为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1时,可以有效保护pDNA-BMP2免受酶的降解。二、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系的构建及性质检测结果:(1)试管倒置法显示CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系均可在37℃下3 min内由可流动的溶胶状态转变为不可流动的凝胶状态;(2)扫描电镜显示,复合体系为多孔的交联网状结构且CSn(pDNA-BMP2)能均匀分散于水凝胶支架的三维网状结构中。三、CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP对HPDLCs细胞相容性的评价结果:(1)成功原代培养HPDLCs,免疫组织化学结果显示,培养的细胞HPDLCs波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明细胞来源于外胚层。(2)结晶紫染色显示,HPDLCs在CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系中形态良好,48h后开始扩增。(3)CCK8实验结果显示,不同浓度的CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体系浸提液在1d和3d时均能促进HPDLCs的增殖,且CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体系浸提液培养的HPDLCs较CS-α,β-GP温敏水凝胶浸提液培养的的细胞增殖更快。结论:(1)CSn具有良好的形态、粒径及电位。(2)CSn能有效结合和保护pDNA-BMP2,CS/CSn(pDNA-BMP2)在N/P为2.5:1时具有最好的形态、粒径及电位。(3)CS/CSn(pDNA-BMP2)-GP复合体系具有温敏性及大孔径,促进HPDLCs的生长和增殖,具备良好的细胞相容性。