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目的:分别应用不同的提取方法对肝癌循环DNA进行提取,从而确定并筛选出高效且稳定的肝癌循环DNA提取方法,为研究新的肝癌诊断方法提供依据。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和甲基化特异性PCR(MSP)的检测方法对肝细胞癌(HCC)患者、乙型病毒性肝炎(HBV)患者及健康体检者血浆游离DNA含量及完整性进行检测,并研究外周血浆游离DNA中TGR5、RIZ1基因异常甲基化情况,探讨其在肝细胞癌(HCC)诊断中的价值,为HCC的诊断提供新的方法和理论依据。方法:1.收集2014年1月-2015年6月广州军区广州总医院肝胆外科确诊的60名HCC患者血浆标本。2.根据不同方法所需样本量分别应用经典的酚氯仿分离法,磁珠法,微柱吸附法,煮沸高温裂解法4种不同的方法以及经过改良后的微柱吸附法进行循环DNA的提取。采用实时荧光定量PCR方法对所提取的循环DNA进行扩增反应,确认提取效果。分析不同提取方法的提取效率及稳定性。3.采用 RT-PCR 技术对各组血浆游离 DNAGAPDH,-actin400、β-actin167 含量及其完整性(β-actin400/β-actin167)进行检测。分析各组患者之间血浆游离DNA GAPDH,β-actin400、β-actin167 含量及其完整性(β-actin400/β-actin167)的表达差异,分析其表达对于肝癌诊断的特异性和敏感性。4.运用甲基化特异性PCR(MSP)检测血浆游离DNA中TGR5、RIZ1甲基化状态。结合其病理资料分析肝癌患者血浆游离DNA中TGR5、RIZ1甲基化状态在肝癌诊断中的特异性和敏感性。结果:1.RT-qPCR扩增成功率为100%,产物熔解曲线为单峰,扩增曲线均达到平台期,说明所设计引物与扩增体系及反应条件均可特异性扩增所需片段。2.应用5种方法从30例血浆样本中提取循环DNA含量分别为(24.52±2.22)ng/ml、(33.97±3.03)ng/ml、(51.10±3.15)ng/ml、(50.01±2.98)ng/ml、(59.97±2.94)ng/ml,另外,对比10次重复提取循环DNA后检测,5种方法的重复性(以CV计)分别为9.2%、8.9%、6.5%、10.67%、5.9%,改良后微柱吸附法明显优于其他4种方法。3.与健康对照组相比,HCC组和HBV组的血浆游离DNA含量和完整性均有明显升高,其差异有统计学意义。4.HCC组血浆游离DNATGR5、RIZ1甲基化率分别为68.8%和60.4%;两者联合检测时HCC组甲基化率为72.99%。正常对照组甲基化率分别5%和2.5%。TGR5、RIZ1甲基化状态与HCC患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数目、HBeAg阳性及TNM分期等病理参数无关(P>0.05)结论:改良后微柱吸附法对于肝癌患者血浆中的游离DNA提取有着较高的效率,重复性较好,所提取的循环DNA可以为RT-qPCR提供模板,适用于肝癌循环DNA的提取以及后续对肝癌循环DNA定量检测在诊断中应用的实验研究。通过RT-PCR方法检测血浆游离DNA中β-actin400/β-actin167完整性以及联合检测患者TGR5、RIZ1甲基化情况,可为原发性肝癌的辅助诊断提供依据。