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论文一大黄素对脂多糖诱导肠上皮细胞缺氧诱导因子-1a/环氧化酶-2通路的干预一、目的观察脂多糖(LPS)处理肠上皮细胞对缺氧诱导因子-1a(HIF-la)及下游炎症相关靶基因环氧化酶-2(COX-2)表达的影响,探讨大黄素干预的可能作用靶点。二、方法建立LPS处理人肠上皮细胞的体外实验模型。1.用Western blot检测LPS不同剂量和不同时间处理组的HIF-la和COX-2蛋白表达的变化趋势；检测LPS和不同剂量大黄素共同干预组的HIF-1a、COX-2、NF-κB抑制因子(IκB-a)和核转录因子-κB (NF-kB)蛋白表达的变化趋势。2.用PCR检测LPS处理组与LPS和大黄素共同干预组HIF-la的mRNA水平。3.用MTT法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响。数据采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。三、结果1.LPS作用可引起HIF-1a表达升高,且有时间和剂量效应关系。随LPS浓度的增加,HIF-la的表达量先增高后降低,在浓度为10-3mg/ml时HIF-1a表达量最高(P<0.05)。作用时间在0.5h HIF-1a表达达峰值,到4h下降至最低,随后又增高(P<0.05)；COX-2蛋白表达变化趋势与HIF-la基本一致(P<0.05)。大黄素可抑制LPS诱导的HIF-1a、COX-2、Phospho-IkB-a和Phospho-NF-kB p65的表达,并有明显量效关系(P<0.05)。2.PCR检测LPS刺激后HIF-la的mRNA水平增高,而大黄素抑制其增高。3.MTT法检测大黄素浓度在0-80μmol/L对细胞增殖无明显影响(0.95±0.02,0.89±0.03,0.88±0.04,0.91±0.03,0.83±0.03,P>0.05)。虽然大黄素在此浓度范围产生了生物学效应,但对细胞基本无药物毒性。四、结论LPS激活肠上皮细胞HIF-1a—COX-2信号通路,且具有时间和剂量依赖性。大黄素可能通过阻断LPS—HIF-1a—COX-2的缺氧通路和LPS—IκB-a—NF-1κB—COX-2的炎症通路,对肠上皮细胞起到保护作用。论文二缺氧再复氧和脂多糖激活肠上皮细胞核转录因子-κB和低氧诱导因子-1a信号通路及大黄素干预作用一、目的观察缺氧(H)、缺氧/再复氧(HR)和脂多糖(LPS)处理肠上皮细胞对低氧诱导因子-1a(HIF-1a)、核转录因子-κB(NF-κB)及二者共同的下游靶基因环氧化酶-2(COX-2)表达的影响,探讨大黄素在肠上皮细胞的缺氧和炎症过程中干预的可能作用靶点。二、方法用H±LPS、HR±LPS处理人结肠上皮细胞株(FHC)来模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程。常氧组：在37℃下用95%空气和5%CO2下培养细胞作为对照。H组：在37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4h。H+LPS组：在厌氧处理基础上同时给予LPS1μg/mL。HR组：缺氧3h后再复氧1、2、3、4h。HR+LPS组：在缺氧3h后再复氧2h的基础上同时给予LPS1μg/mL。大黄素干预组：在H3hR2h+LPS组基础上给予20、40、60.80μmol/L大黄素进行干预。用Western Blot检测HIF-1a、Phospho-IκB-a、Phospho-NF-κB p65和COX-2的变化趋势；相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变。三、结果1.H组：与常氧组相比,NF-κB通路的三个蛋白表达量均增高,且变化趋势一致,在H1h达峰值,然后递减(IκB-a、NF-kB、COX-2组P分别为：P=0.013,0.000,0.005)。 HIF-1a在H3h表达最高,但各组无显著差异(P=0.062)。H+LPS组：四个蛋白的变化趋势一致,表达量均随着H的延长而增加,到H3h达峰后减少(HIF-1a、IκB-a、NF-κB、COX-2组的P分别为：P=0.026,0.011,0.000,0.000)。HR组：随着R的延长,NF-κB通路蛋白的趋势大致递减,到H3hR4h表达量降至最低(IκB-a、NF-κB、COX-2组P分别为：P=0.063,0.000,0.016)。与H组相比,HR组的HIF-la在R过程中表达明显减少,但组间无显著差异(P=0.081)。HR+LPS组：随着R的延长,四个蛋白并无降解,增至R2h-3h达峰(HIF-1a、IκB-a、NF-κB、COX-2组的P分别为：P=0.037,0.001,0.067,0.000)。大黄素同时干预组：大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1a通路表达,存在量效关系。在大黄素浓度为80μumol/L时,蛋白表达量均降至最低(HIF-1a、IκB-a、NF-κB、COX-2组的P分别为：P=0.044,0.029,0.000,0.053)；大黄素后处理组此效应不显著。2.经过HR+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比常氧组生长速度缓慢。四、结论缺氧或炎症均可激活HIF-la的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,但不同刺激会导致这两条通路不同程度激活,在HR过程中,这两条通路的表达水平随着再复氧时间延长而降低,在HR+LPS过程中仍相对高表达,这可能与肠缺血／再灌注损伤的病理生理机制相关：缺血／再灌注损伤会与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生。大黄素可以抑制NF-KB/HIF-1a-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用。