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为了揭示桉树内生细菌对桉树青枯病的生防机制,从而为应用微生态调控方法防治桉树青枯病的研究奠定基础,并为该病的防治研究提供新的思路,本研究从微生物组学的角度对桉树内生细菌的多样性进行了研究。利用光学显微镜和扫描电镜观察、高通量测序技术对无菌培养的桉树组培苗的内生细菌进行了系统的探究,利用高通量测序技术分析了环境和时间因素对桉树内生细菌群落结构的影响,探讨其可调控性,并采用生防细菌组合及其与黄腐酸复配的方法,对桉树抗青枯病的微生态调控研究进行了初步探索。主要研究结果如下:(1)桉树组培苗普遍存在内生细菌。利用光学显微镜在1000倍下观察了赤桉(Eucalyptus camaldulensis)、尾叶桉(E.urophylla)、粗皮桉(E.pellita)三种实生组培苗和尾细桉(E.urophylla×E.tereticornis)三个无性系LH1、L22、L39的组培苗样品的内生细菌,发现这些材料中均存在内生细菌,多为球状和椭圆状,大小为1～2 μm;通过观察计数发现,实生组培苗和尾细桉无性系组培苗样品每个视野中可观察到内生细菌的平均数量分别约为9.0个和14.0个。在扫描电镜5000倍下观察发现,三种实生组培苗的根、茎、叶内均有细菌的分布,形状多为杆状和椭圆状,大小为1～2 μm,尾细桉三个无性系组培苗不同器官内也均有内生细菌的分布,多为杆状,大小在2 μm左右;通过观察计数发现,实生组培苗和尾细桉无性系组培苗样品每个视野中可观察到内生细菌的平均数量分别约为2.0个和5.0个。以上结果说明,桉树体内普遍存在内生细菌,尾细桉无性系的内生细菌数量普遍多于实生苗。利用高通量量测序技术,对赤桉、尾叶桉、粗皮桉三种实生组培苗和尾细桉LH1、L22、L39、尾巨桉(E.urophylla× E.grandis)DH32-29 四种无性系组培苗进行了内生细菌的检测和分析。在不同分类水平上的物种组成分析结果都表现为实生组培苗之间的内生细菌菌群结构更相似,尾细桉无性系之间的菌群结构更相似,但尾细桉不同系列的无性系之间也存在一定差异;在属水平上,实生组培苗中的优势菌属为假单胞菌属Pseudomonas和鞘脂菌属Sphingbium;尾细桉无性系组培苗中的最具优势菌属为罗丹诺菌属Rhodanobacter,另外两个优势菌属为分枝杆菌属Mycobacterium和藤黄色杆菌属Luteibacter,L39还含有比例为43.8%的玫瑰单胞菌属Roseomonas;尾巨桉无性系组培苗DH32-29中,分枝杆菌属Mycobacterium的比例最高,另外两个优势菌属为假单胞菌属Pseudomonas和鞘脂菌属Sphingobium;主成分分析(principal component analysis,PCA)显示,不同实生组培苗之间的内生细菌群落结构差异较小,不同尾细桉无性系之间的具有一定差异,实生组培苗和尾细桉无性系组培苗之间的差异很大;Alpha多样性分析结果显示,实生组培苗样品中内生细菌群落的Shannon指数均高于所有无性系组培苗样品,而在丰富度(Chao1)上,未表现出规律性。综合以上分析,桉树种子实生苗的固有内生细菌群落结构较稳定,不同无性系之间的则具有一定差异,实生苗与无性系之间的内生细菌群落结构差异非常大,且实生苗的内生细菌多样性高于无性系。(2)桉树内生细菌群落结构具有可调控性。以尾巨桉无性系DH32-29为研究对象,利用高通量测序技术检测其在不同环境条件下和不同生长时间的根部材料,分析了其内生细菌在属和种水平上的组成结构及其群落的Alpha多样性和Beta多样性。结果表明,不同环境条件下的2年生桉树根部之间的内生细菌群落结构有一定的差异,但差异不大。炼苗根部样品的OTU数目最高,且其特有OTUs的比例达到了 63.2%,其它样品特有OTUs的比例均在30%及以下;桉树由组培苗到炼苗的时期,根部的内生细菌在属水平上的结构发生了巨大变化,阿菲皮亚菌属Afipia的比例骤降,由炼苗到1年生苗的时期,菌属的结构也发生了比较明显的变化,苍白杆菌属Ochrobactrum的比例明显升高,1年生苗木到3年生苗木的时期,菌属结构的变化程度次之。桉树由组培苗到炼苗的时期,根部内生细菌群落的Chao1指数提高了约1.7倍,Shannon指数提高了约2.6倍,且均达到了最高值;基于非度量多维尺度法(non-metric multidimensional scaling,NMDS)的样本间距离分析结果显示,组培苗样品和炼苗样品的组间距离最大,1年生和3年生桉树样品的组间距离最小。综合以上分析,环境因素对桉树内生细菌群落结构的影响可在炼苗阶段发挥出最显著的作用,且能够显著提高菌群多样性,是调控的最佳时期。所有根部样品中均能检测到3个优势菌属和5个优势菌种的存在,且其中的苍白杆菌属Ochrobactrum、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia均为植物病害的生防细菌资源。(3)桉树抗青枯病的微生态调控。荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)WCS417r与内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CN181组合、黄腐酸、黄腐酸+WCS417r+CN181,对尾巨桉无性系DH32-29幼苗抗病性的提高均有一定的效果。WCS417r+CN181处理桉树苗的发病率在各记录时间均低于空白对照和WCS417r单一处理;黄腐酸处理桉树苗的发病率在第7 d、10 d、15 d均低于对照组及WCS417r+CN181处理,且在第7 d和10 d均显著低于空白对照及WCS417r处理(P<0.05),发病率分别降低了 30.0%、25.0%(7 d),45.0%、35.0%(10 d);黄腐酸+WCS417r+CN181 处理桉树苗的发病率在各记录时间均低于对照组和WCS417r+CN181处理,且在第7 d和10 d均显著低于空白对照及WCS417r处理(P<0.05),发病率分别降低了 30.0%、25.0%(7 d),50.0%、40.0%(10 d);黄腐酸+WCS417r+CN181处理桉树苗的发病率在第5 d和10 d时低于黄腐酸处理,但差异均不显著(P>0.05)。利用高通量测序技术,检测了生防细菌和黄腐酸的不同组合处理DH32-29桉树苗后第10 d的内生细菌群落结构情况,从微生态角度探究内生细菌的动态变化与桉树抗病能力的关系。OTU数目、PCA分析和物种组成分析结果均表明,组培苗由无菌条件转入外界环境后,其内生细菌群落的结构发生了很大变化,处理组样品中菌群结构的相似度最高;组培苗中可检测到的物种丰度很低,其它样品中可检测到的物种丰度都较高;与组培苗和无菌水处理的样品相比,生防细菌单一处理的阳性对照组和不同组合处理的样品中假单胞菌属Pseudomonas和鞘脂菌属Sphingobium的丰度均有较大增长;对提高桉树抗病性效果较好的CN181、WCS417r+CN181、黄腐酸、黄腐酸+WCS417r+CN 181样品中的黄杆菌属Flavobacterium的丰度均较高,且随着抗病性的提高,其比例递增(11.1%、12.6%、15.7%、17.9%),且Alpha多样性分析结果显示,这四种处理的样品中内生细菌群落的Chao1指数都高于其它样品,且显著高于组培苗对照和WCS417r处理的样品(P<0.05),其Shannon指数也显著高于组培苗和WCS417r处理的样品(P<0.05)。由此表明,调控后内生细菌的群落结构可增强桉树抗青枯病的能力,提高黄杆菌属Flavobacterium在桉树体内的比例可能是微生态调控的关键。