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人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)因其具有高度的自我更新特性和多向分化潜能,在再生医学、组织工程、基因治疗等领域都有着巨大的研究和应用潜力。近年来,随着基因打靶技术在人胚胎干细胞中的不断尝试,使得经基因组精确修饰后的干细胞有望成为实现遗传病治疗的有效方式。然而要充分实现联合基因打靶和干细胞两种技术在临床应用的可能,我们还需面对一些潜在的困难,例如自发同源重组介导基因打靶的低效性,基因组修饰后的安全性等问题。我们研究小组前期的实验证实,由本室研发的核糖体基因区(rDNA)打靶载体(pHrn)能有效介导外源基因定点整合至多种细胞系的rDNA区并有效表达,且一系列临床细胞遗传学的证据表明该区域可能是外源基因停泊的安全位点。在此基础上,本研究利用pHrn携带人凝血因子Ⅷ(FⅦ)表达框,对hESCs进行基因打靶,以期获得在rDNA区定点整合FⅧ的hESCs细胞克隆,并通过检测打靶后hESCs的干细胞特性是否改变来初步验证rDNA区打靶的安全性。然后将定点整合FⅧ的hESCs分化为适合血友病移植治疗的特定组织细胞,测定分化细胞的特性和生理功能,为联合rDNA区基因打靶及干细胞技术应用于血友病A的基因治疗提供基础。方法：(1)将pHrnFⅦ质粒线性化后,经电转和核转两种方式转染单细胞化的hESCs,梯度加入G418筛选抗性克隆；(2)挑取筛选出的抗性克隆,利用定点整合PCR及Southen Blot鉴定rDNA区定点整合FⅧ的阳性hESCs克隆；(3)检测定点整合FⅧ克隆的干细胞生物学特性,包括核型鉴定,碱性磷酸酶染色,干细胞表面标志物检测；(4)检测定点整合FⅧ克隆的多潜能性,包括体外定向心肌分化,体外随机向三胚层细胞分化以及体内畸胎瘤形成等实验。(5)由于肝脏是FⅧ的主要合成及分泌器官,因此我们将定点整合FⅧ细胞克隆定向诱导为肝细胞,并通过形态学观测、细胞特异性基因表达、ICG代谢、PAS糖原染色等实验来验证分化后肝细胞的特性及生理功能；(6)我们还将定点整合FⅧ的细胞克隆定向诱导为目前广泛应用于体内移植治疗的间充质干细胞(MSCs),通过形态学观测、流式细胞分析、成骨分化、成脂分化、成软骨分化等验证分化后MSCs细胞的特性及生理功能；(7)RT-PCR及ELISA检测定点整合FⅧ的hESCs以及分化后的肝细胞和MSCs细胞中外源FⅧ的转录及蛋白表达。结果：(1)通过定点整合PCR及Southern Blot,我们获得了分别经电转和核转后定点整合Ⅷ的hESCs克隆各一个,分别命名为ET5及NT59；(2)两株细胞均保持正常核型且碱性磷酸酶阳性,并表达SSEA-4,TRA-1-60等hESCs特异性标志物,表明仍具备干细胞的特性；(3)体外分化结果显示两株细胞均能分化出Nestin、SMA、AFP标志物阳性的三胚层细胞,同时体内畸胎瘤切片观测到了鳞状上皮、肌肉、消化道等三胚层组织,表明打靶后细胞仍具备多向分化能力；(4)将ET5细胞进行定向肝细胞分化后,可见圆形或多边形等典型肝细胞样细胞；通过RT-PCR、 Western Blot、免疫荧光均检测到了AFP、AlbvAAT、CYP7A1、CYP3A4等肝细胞特异性基因的表达；分化而来的肝细胞能成功摄取及排泌ICG染料且PAS染色阳性,初步证明具备成熟肝细胞的代谢及糖原贮存功能；(5)ET5进行定向MSCs分化后的细胞,在多次传代后具有与BM-MSCs趋于一致的典型成纤维样形态,且增殖能力旺盛；流式分析结果表明分化而来的MSCs细胞表面抗原CD34, CD45阴性,CD44, CD73, CD90阳性,与BM-MSCs一致；经间充质系分化检测,显示分化而来的MSCs同样具备向成骨成脂成软骨的分化能力；(6)RT-PCR检测结果发现,在ET5、 ET5分化而来的肝细胞及MSCs细胞中均能检测到外源FⅧ的转录,但是ELISA结果仅检测到了分化后肝细胞中FⅧ蛋白的表达。结论：(1)通过rDNA区打靶载体成功将FⅧ表达框定点整合至hESCs的rDNA区；(2)定点整合FⅧ的hESCs仍然保持多向分化潜能；(3)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为具备特定生理功能的肝细胞；(4)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为MSCs,且与BM-MSCs细胞特性趋于一致,并具备多向分化潜能；(5)定点整合FⅧ的hESCs及其分化而来的肝细胞和MSCs能转录外源FⅦ mRNA,但仅在肝细胞中检测到分泌性FⅧ蛋白。