雷公藤内酯（triptolide，TP）是从卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. F.）中分离出来的一种具有显著的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤和抗生育等生理活性物质，但由于其明显的毒副作用，在临床上的应用受到了极大的限制。近年来药物代谢研究受到越来越多的关注，大量研究结果表明，药物的代谢过程与其活性及毒性密切相关。作为细胞内微粒体单加氧酶系最重要核心组分的细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）与药物代谢关系最密切，它对内源性物质及药物等外源性物质的代谢起着重要作用。雷公藤制剂临床使用时引起的中毒反应个体差异大，不同年龄段病人毒性反应发生率存在明显差异，而且还具有明显的时辰毒理学特征，提示我们TP代谢过程与其毒性反应的相关性值得研究。目前仅有少量关于雷公藤代谢的研究报道。本论文探讨了基于大鼠肝微粒体CYP450酶介导下的TP的代谢过程及鼠龄、性别对其代谢的影响；研究了主要代谢产物的结构及活性、参与TP代谢的CYP450同工酶之一CYP3A诱导剂对TP药物动力学及毒性影响以及TP对CYP450酶活性的影响，为进一步探讨雷公藤毒性机理提供科学依据，也可为临床合理用药及进一步的新药研发提供参考。本论文完成的主要研究工作有：　　 （1）建立了一种简便、快速测定大鼠肝微粒体中TP的HPLC法。TP在1.98～158.20μg/mL范围内呈良好的线性关系，方法的精密度和准确度良好。采用LC/MS方法对TP在大鼠肝微粒体中4种代谢产物进行了初步鉴定，结果显示代谢产物可能均为TP的单羟基化产物。TP在人肝微粒体中代谢产生的3种代谢产物与在大鼠肝微粒体中代谢产物M2、M3、M4相同。采用CYP450选择性抑制剂对参与TP代谢的亚型酶进行研究。结果显示，CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9 介导了TP在大鼠肝微粒体中的代谢。CYP3A4与M2、 M3和M4的形成有关，特别是对M3的生成起着重要的作用。CYP2C9同样与M2、M3和M4的生成有关。CYP1A2主要影响M4的生成，对M1、M2的生成也有一定的作用。在CYP1A1/1A2诱导剂三甲基胆蒽（3-MC）或CYP3A诱导剂地塞米松（DXM）诱导下，TP代谢速率显著提高，Vmax分别是正常大鼠肝微粒体的3.45和 9.58倍，Km分别是3.14和3.57倍。在DXM诱导的大鼠肝微粒体中代谢产物M3显著提高，M4仅有少量生成，而M1和M2均未被检测到，同时产生了一个新的二羟基化产物。　　 （2）对TP在不同鼠龄、性别大鼠肝微粒体中代谢动力学进行了研究。不同鼠龄的雌、雄Wistar大鼠肝微粒体总的CYP450酶水平无显著性差异，但TP的体外代谢动力学却存在鼠龄及性别差异。雄性大鼠中，幼年（4周）与大龄鼠（>12月）的Km、Vmax及内在清除率（Clint）值均相近，而成年鼠（2～3月）的Km值略低，Vmax及Clint值则明显高于幼年与大龄鼠，表明TP在成年鼠肝微粒体中的代谢消除最快；雌性大鼠中，鼠龄对Km和Clint值影响较大，TP在幼鼠肝微粒体中的Clint值约为成年及大龄鼠的3倍。幼年鼠的Km、Vmax及Clint值未显示出性别差异，但成年及大龄鼠的性别差异则很明显。TP在成年及大龄雌性鼠肝微粒体中的代谢产物均未检测到M4，在所有雌性鼠中M2的生成量也极少，显示代谢产物的生成性别差异明显。　　 （3）在TP体外代谢研究的基础上，研究了参与TP代谢的重要CYP450亚型酶CYP3A的诱导剂DXM对TP体内代谢及毒性的影响。TP在DXM 50、100mg/kg诱导4d后的大鼠体内代谢显著加快，这与体外实验结果显示DXM能显著增加TP的代谢速率相吻合。与对照组相比，TP组（0.2 mg/kg，灌胃3d）大鼠血清ALT、AST、MDA水平及肝脏组织TSH、PSH均有显著性差异，肝脏呈现轻微病理性改变，显示TP引起了肝损伤；DXM组（50mg/kg，腹腔注射4d）大鼠血清ALP、BUN水平及肝脏组织TSH、PSH均有显著性差异，显示DXM可能引起了肾损伤及肝脏巯基的损耗；DXM（50mg/kg，腹腔注射4d）与TP（0.1、0.2、0.4 mg/kg， 灌胃3d）联合使用中、高剂量组血清ALT、AST、BUN、Crea、MDA水平及肝脏组织巯基与对照组比较均无显著性差异，ALP水平与对照组比较有显著性差异，但与DXM组比较则有显著性提高，表明TP与DXM合用可以降低TP引起的肝损伤，也在一定程度上可以减少地塞米松对肾的损害。结果提示TP的代谢产物可能具有生理活性，而且毒性可能低于TP。　　 （4）采用HPLC半制备色谱法分别制备了TP的2个主要代谢产物（M3、M4）。利用液-质联用（LC/MS/MS）及核磁共振（1H-NMR、H-H COSY、C-H HMBC）技术对代谢产物进行了结构鉴定。M3为雷公藤原植物中含有的成分雷公藤内酯二醇（Tripdiolide）；M4为19-羟基雷公藤内酯（19-Hydroxytriptolide）。采用MTT法研究了TP及2个主要代谢产物M3、M4对MCF-7、HepG2细胞的毒性作用。结果显示，TP、M3在2～260ng/mL浓度范围内，作用48h后对两种细胞的增殖均具有明显的抑制作用，抑制强度呈现浓度依赖性。TP、M3作用MCF-7细胞的IC50值分别为33.4 ng/mL、112.9 ng/mL，作用HepG2细胞的IC50值分别为90.4 ng/mL、108.7 ng/mL。M4在0.1～26 μg/mL浓度范围内，作用48h后对MCF-7细胞的增殖有明显的抑制作用，IC50为3.2 μg/mL，而对HepG2细胞增殖的抑制作用不明显。用Hochest33258染色在荧光显微镜下观察了TP（130ng/mL）、M3（130ng/mL）、M4（13 μg/mL）可见肿瘤细胞出现核固缩、碎裂、边聚等细胞凋亡表现。细胞毒性实验结果提示，TP主要代谢产物毒性可能低于TP。　　 （5）研究了TP对肝微粒体酶活性的影响。结果表明，TP中、高剂量组（0.04、0.06 mg/kg/d 连续给予7d）可增加Cyt b5的含量，抑制CYP3A活性，对CYP450总量、CYP2E1的活性则无影响；高剂量组诱导了CYP2B1/2B2的活性。　　 本论文研究结果初步揭示了TP在CYP450介导下的代谢规律以及TP在与其他药物联合用药时可能产生相互作用，这对指导雷公藤临床合理用药及进一步研究毒性发生机制有重要意义，也为进行雷公藤新药研制提供了新思路。