目的按照AATB标准,应用慢速梯度降温冷冻保存骨软骨标本,观察保存后软骨细胞存活率及细胞活性的变化,并建立骨软骨组织库,初步应用于临床,为骨软骨移植物临床应用奠定基础。方法年龄在15-45岁之间的捐献者(山东省千佛山医院临床脑死亡的病人,无关节病损),死前做血尿及其他体液常规检查符合捐献条件,于死亡后12小时内,无菌条件下应用Arthrex关节软骨移植器械垂直于膝关节股骨髁与胫骨平台关节面切取直径为6mm、8mm、10mm,骨柱长约10-15mm的圆柱形骨软骨块,共200枚。经10%DMSO处理后无菌独立包装,行慢速梯度降温至-80℃,保存入-80℃深低温冰箱,建立骨软骨组织库。分别在保存1个月、3个月、6个月、1年时随机抽取10枚标本行胎盘蓝染色检测软骨细胞存活率,MTT法检测软骨细胞活性;10枚做组织学和组织化学染色观察软骨细胞组织形态和代谢活性变化。将各时间段保存标本的检测结果与新鲜组对照,评价保存效果,并在冷冻保存早期选取6枚标本应用于临床治疗3例患者膝关节软骨缺损,平均随访2个月,评价临床效果。结果1、软骨细胞存活率的变化新鲜对照组软骨细胞存活率为94.80±4.59,应用梯度降温冷冻保存1个月、3个月、6个月、1年时,细胞存活率分别为66.95±9.98、58.11±9.11、43.74±8.37、29.21±5.03,实验组与新鲜对照组比较均有统计学差异(P<0.05),各保存时间点实验组组间两两比较均有统计学差异(P<0.05)。即深低温冷冻保存对软骨细胞存活率的影响具有动态时间依从性。2、关节软骨PG的变化新鲜对照组关节软骨PG含量丰富,番红O染色为红橙色,经梯度降温冷冻保存1个月、3个月、6个月、1年时,番红O染色逐渐变浅,各组浅、中、深层平均IOD值(表1),各实验组与新鲜对照组比较均有统计学差异(P<0.05),各保存时间点实验组组间两两比较均有统计学差异(P<0.05),即深低温冷冻保存对软骨PG的影响有时间依从性。3、软骨细胞活性新鲜对照组OD值为0.65±0.03,经阶梯降温冷冻保存1个月、3个月、6个月、1年时,OD值分别为0.42±0.04、0.29±0.02、0.21±0.03、0.16±0.04,各实验组与新鲜对照组比较均有统计学差异(P<0.05),各保存时间点实验组组间两两比较均有统计学差异(P<0.05),即深低温冷冻保存对软骨细胞活性的影响有时间依从性。4、无菌操作取材的骨软骨标本经慢速梯度降温至-80℃冷冻保存1月-1年,包装完好,各保存时间点随机抽取标本行细菌培养检测结果均为阴性;临床应用冷冻保存的6枚标本治疗3例关节软骨缺损,术后MRI检查均可见移植骨与宿主骨融合,Brittberg-Peterson功能评分较术前明显降低,显示早期移植效果满意。结论1、深低温保存对关节软骨活性的影响具有动态的时间依从性。随着保存时间的延长,关节软骨活性会逐渐降低;低温导致软骨被冻伤是客观存在的。2、梯度降温深低温冷冻保存可操作性强,能使骨软骨移植物细胞存活时间延长,建立骨软骨组织库具有可行性。3、应用组织库保存的骨软骨移植物治疗关节软骨缺损手术取得了初步临床效果。意义:青少年运动伤导致关节软骨损伤的治疗一直是个难题,骨软骨移植是公认的较为理想的治疗方法。由于供体来源的有限,如何长时间的保存有活性的软骨移植物成为研究者关注的焦点。目前国外已开展了冷冻保存骨软骨组织方法与临床应用研究,国内对关节软骨保存方法的研究还处于探索阶段,软骨组织库基本空白。本课题以人关节软骨为标本,应用10%DMSO预处理后慢速梯度降温冷冻法保存建立实验用软骨组织库,并阶段性研究冻存软骨细胞的存活率及细胞活性,初步应用于临床行关节软骨缺损的治疗,可为软骨组织库建立和临床应用奠定基础。