研究背景严重烧伤后,由于体液丢失导致的休克/缺血缺氧,以及应激,感染等因素,都会引起机体内乳酸、酮酸等代谢产物的堆积,导致机体发生酸中毒(acidosis)。在临床诊断中,动脉血pH值是反映机体酸中毒最为直观的指标之一;由于体内酸碱缓冲系统的失代偿,动脉血pH值会出现不同程度的下降。心脏是机体重要的循环动力器官,既往研究表明,心肌细胞对胞外pH变化非常敏感,动脉血pH的降低可引起严重的心功能损伤,使烧伤病人的死亡率倍增。因此,阐明烧伤休克/缺血缺氧酸中毒导致的心肌损害及其发生机制具有重大的临床意义。自噬(Autophagy)是细胞维持新陈代谢平衡和功能正常的重要生理过程,它通过分解衰老、损伤的细胞器,错误折叠的蛋白等,为细胞提供生存所必须的营养物质和底物,实现细胞器的自我更新。大量的文献资料表明,自噬在细胞生理或者病理条件下发挥重要作用。低氧条件下,自噬流(Autophagy flux)的损伤会引起大鼠心肌细胞活力下降,而饥饿诱导的自噬激活可以在一定程度上代偿细胞营养物质的缺失,维持细胞的生存。我们前期研究发现,酸处理可抑制心肌细胞自噬体(Autophagosome)的生成。但是,自噬如何参与并调控pH降低诱导的心肌细胞损伤,目前尚不十分清楚。研究显示,多种信号通路参与细胞自噬的调控。微管(Microtubule,MT)是哺乳动物细胞内重要的网状骨架结构,在维持细胞形态,调节胞内转运以及细胞迁移等过程中发挥重要作用。微管正常功能的行使需要多种翻译后修饰的参与,如乙酰化、甲基化、糖基化等等,其中微管乙酰化(Microtubule acetylation)是其最重要的修饰方式之一。既往研究结果显示,微管乙酰化与细胞自噬密切相关,乙酰化的缺失可阻碍自噬体的降解。因此,我们推测,pH降低时,微管乙酰化可能参与心肌细胞自噬的调控。组蛋白去乙酰酶6(HDAC6)是胞浆内存在的重要的去乙酰化酶,在多种生理或病理过程中发挥调节作用。在哺乳动物细胞内,HDAC6是微管乙酰化重要的上游调节蛋白,然而,HDAC6是否参与pH降低对心肌细胞微管乙酰化的调控,目前尚无相关报道。因此,本研究提出pH降低通过微管乙酰化调控心肌细胞自噬进而导致细胞损伤的假设,通过体外建立酸处理模型,检测pH降低时自噬调控对心肌细胞酸损害的影响,并通过对HDAC6和微管乙酰化的检测和调控,明确pH降低调控心肌细胞自噬的作用机制。研究方法5.以原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象,通过配制酸性DMEM/F12培养基,体外模拟缺血缺氧酸中毒条件,建立大鼠心肌细胞酸处理模型,观察不同酸性pH(pH7.0、pH6.5、pH6.0),不同处理时间(1、3、6h)的酸处理对大鼠心肌细胞自噬的影响并检测酸处理对大鼠心肌细胞造成的损伤。通过巴弗洛霉素A1(Baf A1,100nM)抑制实验明确pH降低对心肌细胞自噬调控的作用环节。6.通过构建ATG5高表达腺病毒进行转染,在pH降低的处理条件下,上调心肌细胞的自噬水平,Western Blot(WB)检测腺病毒转染的有效性,通过检测乳酸脱氢酶(LDH)释放,细胞计数试剂盒8(cck-8)等方法观察自噬调控后心肌细胞的损伤及活力变化情况,明确自噬对pH降低导致的心肌细胞损伤具有调控作用。7.通过WB及免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)实验检测酸处理条件下心肌细胞微管乙酰化水平的变化情况,使用紫杉醇(Taxol,0.2μM)处理细胞,上调心肌细胞微管乙酰化水平并检测酸处理后自噬水平的改变,同时观察心肌细胞的损伤及活力变化情况,明确在pH降低的条件下,微管乙酰化对心肌细胞自噬具有调控作用。8.通过WB及酶活性试剂盒检测pH降低后HDAC6的蛋白表达及活性的改变,使用Tubastatin A(TBSA,0.2μM)选择性抑制HDAC6的酶活性后,通过WB及免疫荧光检测在酸处理条件下检测观察心肌细胞微管乙酰化水平及自噬水平的变化情况,最后对心肌细胞的损伤及活力变化情况进行检测,明确HDAC6在pH降低诱导的微管乙酰化调控中发挥重要作用。结果5.pH降低导致大鼠心肌细胞损伤、活力下降,同时细胞自噬标志物LC3、p62表达明显下降;通过Baf A1抑制实验我们发现,在使用Baf A1预处理细胞抑制自噬体与溶酶体的融合后,酸处理组的LC3II表达水平较正常组有明显的减少,这表明自噬体的减少是酸处理抑制了心肌细胞自噬体的生成,而不是自噬体的过度消耗所致。6.构建ATG5高表达腺病毒转染心肌细胞,在酸处理条件下上调其自噬水平,通过LDH释放法和cck8法检测,我们发现自噬水平的上调可以明显减少心肌细胞酸损害,改善其活力,表明自噬对pH减低导致的心肌细胞损伤具有调控作用。7.WB及免疫荧光结果显示,酸处理显著下调心肌细胞微管乙酰化水平,我们使用微管稳定剂紫杉醇(Taxol)处理心肌细胞,上调其微管乙酰化水平,检测发现酸处理后自噬体生成较单纯酸处理组明显增多;同时,心肌细胞损伤减轻,活力明显改善,说明在pH降低时,微管乙酰化参与了心肌细胞自噬的调控。8.酸处理后,HDAC6蛋白表达水平无明显变化,但其酶活性显著升高。在酸处理条件下应用Tubastatin A选择性抑制HDAC6活性后,心肌细胞微管乙酰化水平明显上调,同时,通过对自噬标志物LC3和p62的检测以及免疫荧光实验发现,自噬体的生成亦明显增多,表明HDAC6在pH降低诱导的微管乙酰化水平下调中发挥了重要的调控作用。最后通过对心肌细胞损伤和活力改善的情况进行检测,发现选择性抑制HDAC6活性可减轻心肌细胞酸损害,改善细胞活力,进一步佐证了我们的结论。结论pH降低后,心肌细胞HDAC6活性升高,通过下调微管乙酰化水平,引起自噬体生成障碍,最后导致心肌细胞受损,活力下降。以上结果提示自噬参与了pH降低诱导的心肌损伤调控,而由HDAC6调节的微管乙酰化改变是其重要的调控机制,该结论进一步丰富了烧伤后心肌细胞损害的理论认识,为烧伤病人心肌损害防治提供了新的靶点。