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脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,因它具有独特的侵袭性而难以治疗,因此寻找脑胶质瘤新的治疗靶点具有重要意义。近年来研究表明,肿瘤抑制因子PAX6在胶质瘤的发生发展过程中是一种抑制性调控因素,它的高表达能抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭,但PAX6在胶质瘤的表达水平明显低于邻近正常组织,提示探索胶质瘤中PAX6表达降低的确切机制,有望为明确胶质瘤的侵袭性指明新思路。miRNAs属于一类小的、非编码的单链RNAs,它可以通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合,引起靶基因mRNA降解或翻译受阻,从而在转录后水平调节蛋白的表达。miRNAs具有多种生物学作用,研究表明miRNAs的异常表达在肿瘤的发生和进展中起重要作用,miRNAs作为抑癌基因还是致癌基因取决于它们相关靶基因的功能。在不同类型的肿瘤细胞中miR-223通过靶向不同的功能基因而表现出不同的作用。胶质瘤的生长和转移与不同的miRNAs有关,然而在脑胶质瘤中miR-223的生物学功能目前还不清楚。此外,与PAX6相关的miRNAs的报道非常少见,在脑胶质瘤中,miR-223是否可以靶向作用于PAX6需要进一步证实。本研究中,我们首先检测了脑胶质瘤细胞系U251、U373和组织中miR-223和PAX6的表达水平,进一步用生物信息学方法预测了调控PAX6的miRNAs,以及miR-223对PAX6表达的影响,探讨了不同表达水平的miR-223、PAX6对脑胶质瘤细胞系U251、U373细胞增殖、细胞周期和侵袭的影响,初步探讨miR-223作为脑胶质瘤治疗新靶点的可行性。目的：1.研究脑胶质瘤细胞系和脑胶质瘤组织中PAX6的mRNA、蛋白和miR-223表达水平,以及两者的靶向关系；2.观察不同表达水平的miR-223对PAX6表达的影响；3.探讨miR-223靶向PAX6对脑胶质瘤细胞生长和侵袭的影响。方法：1.脑胶质瘤组织和细胞中miR-223及PAX6的差异性表达及靶向关系(1)采用qRT-PCR法检测脑胶质瘤细胞系(A172、U251、U373、 U138、XB1330)与正常人胚脑胶质细胞(HFGC)中miR-223和PAX6mRNA的表达水平；(2)利用组织芯片技术,检测不同病理分期的脑胶质瘤组织与正常脑组织中PAX6蛋白的表达；(3)生物信息学软件预测调控PAX6的miRNAs,初步确定miR-223与PAX6的靶向关系；(4)双荧光素酶报告基因实验验证miR-223与PAX6的靶向关系。2.脑胶质瘤细胞系U251、U373中miR-223对PAX6表达的影响(1)通过化学合成的方法,合成miR-SCR, anti-Con, miR-223mimics和anti-miR223,分别转染U251、U373细胞,构建miR-223功能获得模型和功能丧失模型,qRT-PCR法检测模型中miR-223表达水平；(2)构建PAX6过表达/抑制表达模型,分别转染U251、U373细胞；qRT-PCR、Western Blot检测PAX6mRNA和蛋白的表达水平,以此观察质粒转染或病毒感染后目的基因的表达效率；(3)qRT-PCR、Western Blot法检测不同表达水平miR-223对PAX6mRNA和蛋白表达的影响。3.miR-223靶向调控PAX6在脑胶质瘤细胞中的作用研究(1)MTT检测细胞的生长情况；(2)流式细胞术检测细胞的周期变化；(3) Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力；(4) Western Blot检测侵袭相关因子MMP2、MMP9和血管生成调控因子HIF1α、VEGFA的表达水平。结果：1.脑胶质瘤组织和细胞中miR-223及PAX6的差异性表达及靶向关系(1) qRT-PCR结果显示,miR-223在脑胶质瘤细胞系中均有表达,与正常人胚脑胶质细胞(HFGC)相比较,各胶质瘤细胞系中miR-223的表达均明显升高；其中miR-223的表达量以在U138、XB1330细胞中的表达最高(p<0.001),在U251、U373细胞中的表达居中(p<0.01),在A172细胞中的表达较高(p<0.05)。(2)组织芯片结果显示,在正常脑组织中PAX6蛋白表达量明显高于脑胶质瘤组织,而且随着脑胶质瘤分期程度的增高,PAX6蛋白表达量明显降低。(3)生物信息学软件预测结果显示,调控PAX6的miRNAs是miR-223；(4) qRT-PCR结果显示,PAX6在脑胶质瘤细胞系中均有表达,与正常人胚脑胶质细胞(HFGC)相比较,各胶质瘤细胞系中PAX6的表达均明显降低；其中PAX6的表达量以在U138、XB1330细胞中的表达最低(p<0.001),在U251、U373细胞中的表达居中(p<0.01),在A172细胞中的表达较高(p<0.05)。(5)双荧光素酶报告基因检测结果显示,共转染miR-223mimics和PAX63’-UTR-psiCHECKTM-2重组质粒的细胞样本中,荧光素酶活性强度相比其它组显著下降,miR-223mimic显著地抑制了PAX63’-UTR荧光素酶报告基因的活性,说明miR-223与PAX6基因3’-UTR区存在靶向作用关系；通过miR-223inhibitor与PAX6Mut3’-UTR-psi CHECKTM-2重组质粒的共转染发现,荧光素酶活性强度变化没有显著性差异,且不受miR-223inhibitor的影响,但PAX63’-UTR抑制效果非常明显,且抑制作用能够被miR-223inhibitor所逆转。2.脑胶质瘤细胞中miR-223对PAX6表达的影响(1)成功构建了shRNA-PAX6慢病毒表达质粒,测得其平均滴度为6.73×108TU/mL；(2)成功构建了PAX6-pcDNA3.1真核表达质粒；(3)miR-223在U251、U373细胞中的表达检测qRT-PCR结果显示,在脑胶质瘤细胞系U251、U373细胞中,分别转染miR-SCR, miR-223mimics, anti-Con和anti-miR223后,其中以转染miR-223mimics的表达量明显增高,这种作用可被转染anti-miR223逆转,即能降低miR-223的表达量,也说明了过表达或沉默miR-223模型构建成功。(4)PAX6在U251、U373细胞中的表达qRT-PCR结果显示在脑胶质瘤细胞系U251、U373细胞中,转染PAX6-pcDNA3.1过表达质粒,PAX6mRNA表达升高,Western Blot结果亦显示PAX6蛋白表达升高；感染shRNA-PAX6’漫病毒,PAX6mRNA和蛋白的表达降低；也说明了过表达或沉默PAX6模型构建成功。(5)miR-223对PAX6表达的影响U251、U373细胞转染miR-223mimics, qRT-PCR结果显示PAX6mRNA的表达降低,Western Blot结果显示PAX6蛋白表达亦降低；而转染anti-miR223, PAX6mRNA和蛋白的表达均升高。3.miR-223靶向调控PAX6在脑胶质瘤细胞中的作用研究(1)MTT检测细胞增殖转染PAX6-pcDNA3.1过表达质粒48h后,在U251、U373细胞中,细胞增殖能力开始明显降低,以72h下降最显著；而转染慢病毒shRNA-PAX6质粒48h后,细胞的增殖能力均开始明显增高,以72h增高最显著；而miR-223过表达后,48h细胞均出现增殖能力明显增强；而抑制miR-223的表达,48h出现细胞增殖能力降低；(2)流式细胞术检测细胞周期在U251、U373细胞中,转染PAX6-pcDNA3.1过表达质粒,导致G1期细胞数明显增加, S期细胞数减少,即细胞周期阻滞于G1期,抑制G1期向S期的转换；而转染慢病毒shRNA-PAX6质粒48h后,G1期细胞数减少,S期细胞数明显增加,即促进细胞周期G1期向S期的转换；过表达miR-223,G1期细胞数减少,S期细胞数明显增加,即促进细胞周期G1期向S期的转换,转染anti-miR223后,G1期细胞数增加,S期细胞数明显减少,即抑制细胞周期G1期向S期的转换；(3)不同PAX6表达水平时Transwell侵袭实验检测当PAX6过表达后,两种脑胶质瘤细胞系U251、U373细胞水解Matrigel胶并穿过Transwell小室基底膜的细胞数明显降低；而PAX6表达沉默后,两种脑胶质瘤细胞系U251、U373细胞水解Matrigel胶并穿过Transwell小室的细胞数目较对照组增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。(4)不同miR-223表达水平时Transwell侵袭实验检测miR-223过表达后,穿过Transwell小室基底膜的细胞数目较对照组明显增多,抑制miR-223的表达后,两种脑胶质瘤细胞水解Matrigel胶并穿过Transwell小室的细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)U251、U373细胞中各因子Western Blot检测结果miR-223过表达使MMP2, MMP9, HIF1α, VEGFA蛋白的表达明显增加,转染anti-miR-223后,MMP2, MMP9, HIF1α, VEGFA蛋白表达降低；PAX6过表达使MMP2, MMP9, HIF1α, VEGFA蛋白表达明显降低,干扰PAX6的表达后,MMP2, MMP9, HIF1α, VEGFA蛋白表达增加,呈现与miR-223过表达一致的效应。结论：1.在脑胶质瘤细胞中,miR-223高表达与PAX6低表达呈现负相关；2.miR-223靶向作用PAX6的3’-UTR抑制PAX6的表达；3.PAX6表达水平的改变影响细胞活力、细胞周期和侵袭力,其机制可能与侵袭相关因子MMP2、MMP9和血管生成调控因子HIF1α、VEGFA蛋白的表达水平改变有关；4.miR-223靶向调控PAX6的表达水平进而影响细胞活力、细胞周期和侵袭力。