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目的:(1)统计分析我院2015年4月-10月临床送检微生物标本中鲍曼不动杆菌(Ab)的Ⅰ类整合子(intI)检出率、耐药性及生物膜形成率;建立Ab体外生物膜(BF)模型,采用扫描电镜观察生物膜形成过程;(2)检测红霉素破坏鲍曼不动杆菌生物膜后Ⅰ类整合酶基因(intI1)mRNA的表达情况,初步探讨红霉素破坏Ab生物膜与Ⅰ类整合子的关系,进一步探明红霉素破坏Ab生物膜机制,从而为临床用药提供实验依据,更好的指导临床抗生素的合理使用,同时也有益于研发新的临床药物。 方法:(1)收集我院2015年4月-10月临床送检的微生物标本,全自动细菌分析仪鉴定为Ab,普通PCR鉴定Ⅰ类整合子阳性菌,K-B纸片扩散法检测Ab药物敏感情况,阿利新蓝-刚果红染色鉴定Ab生物膜,选取能形成BF的Ab菌株建立生物膜体外模型,分别在24h、48h、72h、5d扫描电镜观察Ab生物膜形态。(2)选取AbⅠ类整合子阳性菌中生物膜阳性菌株和阴性菌株,实验分为A、B、C3大组:组A为生物膜培养状态下的Ab生物膜菌,组B为Ab不成膜菌,组C为液相培养状态下的A组菌。每组内设实验组1(加红霉素)和对照组2(不加红霉素)。分别于24h、48h、72h、5d荧光定量PCR检测I类整合酶基因mRNA的表达情况。mRNA相对表达数据采用2–△△CT法进行分析,用SPSS22进行统计学分析。 结果:(1)本课题共收集临床送检Ab64例,检出I类整合子阳性菌54例;药敏结果显示Ⅰ类整合子基因盒阳性菌株对哌拉西林、头孢哌酮、头孢他啶、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素等抗生素的耐药率明显高于未携带整合子相关基因盒的菌株,提示I类整合子在Ab临床分离株中发挥耐药作用;阿利新蓝-刚果红染色,其中Ⅰ类整合子阳性菌成膜率高约为81.5%;扫描电镜观察:Ab在培养72h时形成成熟生物膜,且Ⅰ类整合子阳性株较阴性株细菌密集且成膜明显。(2)本研究对红霉素在破坏Ab生物膜中的作用机制进行了研究,采用普通PCR检测到Ab在液相浮游菌、生物膜菌两种不同生长状态下,都有Ⅰ类整合子整合酶基因mRNA的表达;采用荧光定量PCR技术对该菌在以上实验分组条件下Ⅰ类整合酶基因mRNA转录水平进行定量分析,发现A2组I类整合酶基因的mRNA表达水平在多个时间点极显著(p≤0.01)高于B2组,显著性(p<0.05)高于C2组,且随着时间的推移差异越大,1d和5d后分别是B2组的2.39、15.67倍,C2组的2、4.06倍,说明生物膜有利于intI1的表达;实验组和对照组,在红霉素作用后1d,Ⅰ类整合酶基因的mRNA表达出现下降,作用后3d mRNA表达出现明显下降,其中在红霉素作用后5d差异性表达最为极显著(P≤0.01),A2、B2、C2分别为A1、B1、C1的40.78、35.26、29.45倍。A1较A2组在各个时间点表现为显著性(p<0.05)下调,说明红霉素对intI1的mRNA的表达有影响;B1较B2组在各个时间点表现为显著性(p<0.05)下调,说明红霉素可以破坏Ⅰ类整合子;C1较C2组在各个时间点表现为显著性(p<0.05)下调,进一步说明红霉素可以破坏Ⅰ类整合子。本研究结果提示Ab生物膜的形成有利于整合子及相关耐药基因的传播,红霉素可能在破坏AbⅠ类整合子上起到一定的作用。对研究整合子在生物膜中的作用机制及细菌耐药性形成传播提供实验依据,并为进一步开发新的药物以及控制细菌耐药性的形成及播散提供新的思路。 结论:(1)我院AbⅠ类整合子阳性检出率高,且较阴性菌易形成生物膜,耐药率高;(2)Ab在生物膜状态下Ⅰ类整合酶基因mRNA的表达较液相状态表达高;红霉素可能通过破坏Ⅰ类整合子从而对鲍曼不动杆菌生物膜的破坏起到一定作用。