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目的:本研究旨在探讨细胞因子IGF-Ⅰ、TNF-α对去子宫大鼠卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及E2、P分泌的影响。
方法1.动物:实验选用35只成年雌性Sprague-Dawley大鼠。选取30只并分6组(模型组、IGF-Ⅰ1组、IGF-Ⅰ2组、IGF-Ⅰ3组、IGF-Ⅰ4组和TNF-α组,每组5只),手术切除子宫,保留双侧卵巢。其余5只作为正常对照组行假手术。全部大鼠均在相同条件下喂养3个月。
2.卵巢颗粒细胞培养:3个月后,经阴道涂片确定动情周期。当大鼠处于发情前期时将其处死。取发育中卵泡的颗粒细胞进行原代细胞培养。使用含10%FBS的DMEM培养基,将Gcs浓度调至实验所需,接种于多孔培养板,置37℃、5%CO2培养箱中孵育。24h后,在所分的各组颗粒细胞中,分别加入IGF-Ⅰ(1.2,12,60,120ng/ml)、TNF-α(60ng/ml),继续培养5天。
3.关于细胞增殖:3.1应用四唑盐比色法(MTT法)观察细胞增殖;3.2应用彩色图像分析系统比较各组细胞形态学特征。
4.关于细胞凋亡:4.1流式细胞仪测定各组细胞凋亡率(碘化丙啶染色);4.2荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况(吖啶橙染色);4.3彩色图像分析系统比较各组细胞形态学特征(HE染色)。
5.关于卵巢E2、P:每日换液时收集上清液,冷冻干燥后,-40℃低温冰箱保存。放射免疫方法测定E2、P。
结果1.卵巢颗粒细胞增殖形态学及增殖率的变化:模型组较正常组增殖降低;IGF-Ⅰ组较模型组增殖降低减缓,存在剂量-效应关系(1.2~120ng/ml);而TNF-α组(60ng/ml)较模型组增殖降低加剧。
2.卵巢颗粒细胞凋亡形态学及凋亡率的变化:模型组较正常组凋亡升高;IGF-Ⅰ组较模型组凋亡升高减缓;而TNF-α组较模型组凋亡升高加剧。
3.卵巢E2、P的变化:模型组较正常组E2、P降低;IGF-Ⅰ组较模型组E2、P降低减缓,存在剂量-效应关系(1.2~120ng/ml);而TNF-α组较模型组E2、P降低加剧。
结论:1.子宫切除后,大鼠卵巢颗粒细胞增殖减低,凋亡增加,E2、P水平降低。
2.外源性IGF-Ⅰ促进去子宫大鼠卵巢颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,抑制E2、P水平降低。
3.外源性TNF-α抑制去子宫大鼠卵巢颗粒细胞增殖,促进细胞凋亡,促进E2、P水平降低。