恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，高居疾病死亡率的第二位，在传统的放疗、化疗和手术治疗都无法奏效的情况下，肿瘤基因治疗迅速发展成为攻克这种严重危害人类生命的疾病的新的希望。 基因转运系统是基因治疗最重要的环节，在肿瘤的基因治疗研究中，腺病毒载体是应用最多的一种病毒载体，其宿主范围广，能够高效率的感染分裂和非分裂细胞，能够容纳较大的外源基因片断，载体基因不整合到宿主基因组中，另外腺病毒载体比较容易获得高滴度的纯化病毒。然而宿主宽广同时也是腺病毒载体用于肿瘤治疗的一个障碍，因为机体大部分组织细胞表面均存在腺病毒—柯萨奇病毒受体（CAR），而且不同细胞表面CAR的表达水平不同，特别是某些肿瘤细胞表面的CAR较相同起源的正常组织细胞减少，使得腺病毒不能有效感染肿瘤细胞，治疗效果不理想。因此提高重组腺病毒载体对肿瘤细胞的感染效率，降低其对正常组织的损伤，已成为肿瘤基因治疗研究的热点。 表皮生长因子受体（EGFR）的异常高表达常见于多种实体肿瘤，并与多种恶性肿瘤的发生、发展和预后等密切相关。因此，EGFR已成为相关肿瘤治疗研究的重要靶标。本研究旨在建立一种靶向EGFR的基因导入系统，通过一个双功能连接分子引导腺病毒到达高表达EGFR的肿瘤细胞表面，从而提高腺病毒对肿瘤细胞的感染效率，降低其对正常组织细胞的损害，为肿瘤的靶向性基因治疗提供可靠的理论依据与实践指导。 第一部分 肿瘤细胞表面受体表达水平与腺病毒感染效率的关系 【目的】探讨肿瘤细胞表面腺病毒—柯萨奇病毒受体（CAR）、整合素（integrin）和CD46的表达水平与不同血清型腺病毒感染效率的关系，为下一步研究腺病毒靶向基因治疗奠定基础。 【方法】采用实时荧光定量RT-PCR，Western blot，流式细胞技术和免疫组织化学染色等方法检测几种不同细胞系来源的肿瘤细胞表面腺病毒—柯萨奇病毒受体（CAR）、整合素（integrin）和CD46的表达水平。用携带指示基因GFP或者Luciferase的腺病毒Ad5-CMV-GFP、Ad5F35-CMV-GFP和Ad5-CMV-luc感染肿瘤细胞，流式细胞仪和luciferase Assay测定GFP及luciferase表达水平，确定腺病毒感染率和外源基因表达水平。通过转染CAR的真核表达质粒瞬时提高肿瘤细胞表面CAR的表达，以及采用CAR和integrin抗体分别封闭细胞表面受体，或用抗knob抗体先与腺病毒结合，阻断腺病毒感染肿瘤细胞，然后检测并比较腺病毒感染效率的变化。 【结果】分别用实时荧光定量RT-PCR，Western blot，流式细胞技术和免疫组织化学染色等方法检测肿瘤细胞表面腺病毒—柯萨奇病毒受体和整合素的表达水平，不同肿瘤细胞表面CAR和integrin的表达水平是不同的，几种方法检测所得结果是基本一致的，其中SMMC-7721署HA549细胞CAR的表达量最高，而K562细胞CAR的表达水平最低；所检测的几种肿瘤细胞integrin都有一定的表达，其中SK-OV-3和A549细胞的integrin表达最高，而K562表达最低。 荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5-CMV-GFP和Ad5F35-CMV-GFP对肿瘤细胞的感染效率，结果显示5型腺病毒对于SMMC-7721和A549细胞的感染效率最高，而对于HXO-RB₄₄和K562则很低。5型腺病毒的感染效率与细胞表面CAR和integrin的表达水平呈正相关。 成功构建了表达腺病毒—柯萨奇病毒受体（CAR）的重组质粒pCDNA3.1-fCAR，用脂质体瞬时转染各种肿瘤细胞后，可使5型腺病毒的感染效率大幅度提高，其中对A549感染效率提高了约10倍，对SK-OV-3提高了4.4倍，对于K562提高了3.4倍，对HXO-RB₄₄和SMMC-7721分别提高了1.8倍和1.2倍。 用抗CAR和knob的抗体阻断腺病毒对SMMC-7721和SK-OV-3的感染，相同的抗体浓度下，腺病毒对SMMC-7721感染效率的降低比SK-OV-3更为显著。在应用抗integrin抗体阻断时，腺病毒对SMMC-7721和SK-OV-3的感染效率都显著下降，对于SK-OV-3的阻断更为明显。 【结论】肿瘤细胞表面CAR和integrin的表达水平与5型腺病毒感染细胞的效率呈正相关。通过转染质粒pCDNA3.1-fCAR人为提高肿瘤细胞表面CAR的表达水平，能够使腺病毒对细胞的感染效率显著提高。用抗CAR、knob或者是integrin的抗体阻断腺病毒感染，可显著降低腺病毒的感染效率，其中抗integrin抗体所阻断的感染效率最为显著，说明integrin在病毒的感染中起着非常重要的作用。第二部分 双功能融合分子对腺病毒的感染效率的提高 【目的】为了提高腺病毒载体对肿瘤细胞的感染效率，我们根据大多数的实体瘤细胞EGFR表达上调的特点，构建了能够表达融合蛋白sCAR-EGF的腺病毒载体，探讨该融合分子对于提高腺病毒感染肿瘤细胞效率的作用。为提高腺病毒介导的治疗基因的肿瘤靶向性传递效率提供新的手段和工具。 【方法】采用PCR和体外连接的方法构建了腺病毒—柯萨奇病毒受体胞外段（soluble Coxsackie B virus-Adenovirus Receptor）sCAR和表皮生长因子（Epidermal Growth Factor）EGF融合基因，然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315。利用Ad-MAX腺病毒包装系统，将重组穿梭质粒pDC315-sCAR-EGF与携带腺病毒主要基因的大质粒pBHGlox△E13cre共同转染293细胞，包装出表达融合蛋白sCAR-EGF的腺病毒。用携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-GFP和Ad5-CMV-luc检测双功能融合分子对于提高腺病毒对肿瘤细胞感染效率和外源基因表达水平的作用。分别采用抗EGFR和抗CAR抗体与腺病毒孵育，检测抗体阻断对于融合分子介导的腺病毒感染的作用。 【结果】成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF。经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片断，Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白。体外试验证实该病毒感染及其所产生的融合蛋白能够引导携带指示基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞，对SK-OV-3细胞的感染效率提高了约30倍，对A549细胞也提高了约9倍，感染效率的提高与肿瘤细胞表面EGFR表达水平呈相关，也与双功能分子的剂量存在明显的相关性，抗EGFR抗体能有效阻断腺病毒的感染，而抗CAR抗体的阻断作用不明显。 【结论】融合分子sCAR-EGF可明显提高了腺病毒对肿瘤细胞的感染效率。抗EGFR抗体能有效阻断腺病毒的感染，而用抗CAR的抗体阻断作用不明显，说明经过融合分子介导腺病毒的吸附内吞不再依赖其天然受体CAR，而由EGFR决定。融合分子sCAR-EGF的应用改变了腺病毒的天然嗜性，使肿瘤细胞表面的EGFR替代了天然受体CAR，提高了腺病毒对肿瘤细胞的感染效率。为高水平表达EGFR的肿瘤的靶向性基因治疗提供了新的手段和工具。