高血压作为最常见的慢性病,是心脑血管疾病最主要的独立危险因素,在全球范围内广泛存在并严重危害着人类健康。高血压的发病机制与环境因素密切相关,长期的应激刺激可导致高血压疾病的发生。动物或人长期处于应激状态下会出现心率增快、血压升高等心血管功能亢进的反应,并能逐渐发展为应激性高血压。伴随现代社会生活压力的增加,长期从事精神紧张工作人群的应激性高血压患病率显著升高。临床上高血压的发生大多会经历一个从正常血压(120 mmHg/80 mmHg)向一期高血压(≥140 mmHg/90 mmHg)发展的缓慢过程,即高血压前期阶段。美国高血压预防、诊断、评价与治疗联合委员会的第7次报告中首次正式提出了"高血压前期"的概念,是指收缩压在120-139 mmHg之间和或舒张压在80-89mmHg之间的阶段。大量流行病学证据表明,高血压前期在某些国家的发生比例高达30%-50%。应激性高血压的发病过程经历了一个从生理向病理演变的高血压前期阶段,即应激性高血压前期(stress-induced prehypertension,SIPH)。高血压前期常合并传统心血管疾病危险因素,并且与心血管疾病的发病密切相关。有研究指出在SIPH阶段出现了亚临床靶器官的损害以及相应基因和蛋白表达的改变。因此对SIPH及时进行预防性干预,将能有效遏制高血压的发生,并可保护靶器官、降低心脑血管疾病的发病率。而针刺作为一种替代药物的治疗方法,具有便捷、安全、少不良反应等突出优势,已用于治疗包括高血压在内的多种心血管疾病。高血压是一种受大量基因调控的多基因疾病,心脏是高血压病最容易累及的靶器官,针刺可通过调控特定基因的表达从而起到降压和心脏保护作用。本课题组既往研究发现SIPH模型大鼠出现血管内皮功能异常、心肌损害等现象,针刺可有效调控SIPH模型大鼠的血压,对血管内皮因子一氧化氮、乙酰胆碱、神经肽Y等均有影响,对血管内皮功能具有保护作用。本实验采用基因芯片技术观察针刺对SIPH大鼠心脏基因表达谱的影响,以探究针刺对SIPH的降压以及心脏保护作用机制。研究目的:探究针刺对SIPH大鼠心脏基因表达谱的影响效应,寻找针刺调控SIPH的干预靶点,以揭示针刺对SIPH的降压以及心脏保护作用机制。研究方法:实验一:针刺对SIPH大鼠血压及心肌组织形态学的影响将36只雄性Wistar大鼠随机分为空白组,模型组和模型+针刺组,每组各12只。运用足底电击结合噪声的复合刺激方法对模型组与模型+针刺组大鼠进行为期11天的造模,制备SIPH大鼠模型,并在造模过程中对模型+针刺组进行针刺干预。分别在造模前1天以及造模第3、5、7、9、11天测量大鼠收缩压(Systolic pressure,SP),并于造模结束后第二天进行取材,运用HE染色法观察各组大鼠心肌组织形态学变化。实验二:针刺对SIPH大鼠心肌基因表达谱的影响采用Rat Gene 2.0 Array技术观察三组大鼠心肌基因表达谱的改变,以(P<0.05,Fold Changes>1.5 or Fold Changes<-1.5)为标准筛选差异表达基因。运用GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析对致病相关差异基因以及针刺治疗后的反应基因进行相关生物学功能与通路分析,以期揭示针刺调控SIPH的干预效应机制,为高血压病的防治提供科学依据。实验三:针刺对S1PH大鼠心肌组织中HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4 mRNA表达的调控通过检索 National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库以及查阅文献资料,从三个组的共同差异表达基因中筛选出与SIPH发病及针刺治疗均密切相关的基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4作为关键基因,运用荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)对其 mRNA 表达量进行验证。通过观察造模后及针刺治疗后SIPH大鼠心肌HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4 mRNA的表达变化,探讨针刺改善SIPH的分子生物学机制。研究结果:实验一:血压结果显示从造模开始直至造模第11天结束,模型组大鼠SP持续升高并一直保持在高血压前期水平,与空白组大鼠SP相比,均具有极显著性差异(all,P<0.01)。造模过程中,大鼠出现了明显的体征及行为学改变,出现情绪紧张、易激惹、眼睛充血外凸等现象。造模结束时模型大鼠出现心肌细胞排列紊乱、松散,细胞核变大或溶解等一系列组织病理学改变。提示造模成功。与模型组相比,模型+针刺组大鼠SP在针刺第5、第7天明显降低,有极显著性差异(all,P<0.01),针刺第9、第11天,有显著性差异(all,P<0.05)。说明针刺太冲、曲池穴对SIPH有明显的降压作用。模型+针刺组大鼠的大部分心肌细胞结构正常,部分细胞核形态发生改变,损伤程度轻于模型组大鼠,说明针刺可改善高血压靶器官心脏的损害,具有心保护作用。实验二:基因芯片结果显示,模型组与空白组相比有192个差异表达基因,其中126个下调,66个上调;模型+针刺组与模型组相比,有169个差异表达基因,其中39个下调,130个上调。有49个基因是三个组的共同差异表达基因,其在模型制备以及针刺干预后均发生显著的表达差异,通过检索NCBI数据库以及查阅大量文献,从中筛选出与SIPH发病及针刺治疗均密切相关的基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4,把它们作为关键基因。GO功能富集分析结果显示模型组与空白组的差异表达基因主要功能是节律过程(rhythmic process)、生理节律(Circadian rhythm)、平移伸长(translational elongation)、核糖体(ribosome)等,模型+针刺组与模型组的差异表达基因主要功能是胞质核糖体(cytosolic ribosome)、核糖体亚基单位(ribosomal subunit)、翻译延伸等(translational elongation)、胞质成分(cytosolic part)。KEGG 通路分析显示有 6 条通路既是与模型组VS空白组差异表达基因相关的通路,同时也是与模型+针刺组VS模型组差异表达基因相关的通路。其中rno03010:Ribosome是富集度最高的通路,与SIPH的发病及针刺治疗SIPH均密切相关。通过检索GenomeNet、KEGG PATHWAY Database数据库以及查阅文献资料,发现rno04115:p53信号通路与高血压及心脏病的发病密切相关。由此推测rno03010:Ribosome与rno04115:p53信号通路是针刺调控SIPH的关键通路。实验三:与空白组相比,模型组基因HbA1c、Car4的表达均显著升高(P<0.01),Igfbp-3、Pik3ca的表达显著下降(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,模型+针刺组HbA1c、Car4的表达显著下降(P<0.01,P<0.05),Igfbp-3、Pik3ca的表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。PCR结果与芯片结果相一致。提示:针刺调节SIPH大鼠血压的机制可能与调控高血压相关基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca和Car4的表达有关。结论:1.针刺太冲、曲池穴对SIPH大鼠具有明显的降压效应并且对大鼠心肌损伤具有一定程度的保护作用。2.针刺太冲、曲池穴可对SIPH大鼠心肌基因表达谱产生影响。3.SIPH大鼠心肌关键基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4的mRNA异常表达可能是SIPH发病的重要分子生物学机制,而针刺太冲、曲池穴降压及心保护作用可能是通过调控关键基因的表达及其信号转导通路实现。