研究目的： p15、p16基因是重要的多肿瘤抑制基因(Multiple tumor Suppressor，MTS)，在很多人类原发性肿瘤和细胞株中发生了变化，特别是在胆胰肿瘤中，其频繁的突变率显示有一定的器官特异性改变。p15、p16在结构上十分相似，然而在活体功能上两者又有比较明显的差异，它们在细胞周期进程及细胞增殖调控中是同时发挥作用，还是其中一个起主导作用，有待进一步阐明。本研究先用免疫组化方法对胆道肿瘤p15、p16蛋白表达进行检测，了解其在胆系癌发生、发展过程中的变化，并近一步利用转基因技术将p15、p16基因分别转入人胆管癌细胞系QBC939，对比研究p15、p16基因抑制人胆管癌细胞增殖的差异，拟揭示p15、p16在功能上的不同，为手找新的筛查胆道肿瘤的分子生物学标记提供佐证，探寻胆系癌抑癌基因替代疗法新的适合目的基因。材料和方法：1．取1995年5月至2002年10月江苏省人民医院归档保存蜡块胆管癌10例，胆囊癌30例，结石性慢性胆囊炎与胆固醇性胆囊息肉各10例，采用SP法对抑癌基因P15、P16表达进行检测。2．P15、P16真核表达载体的构建及重组质粒的鉴定：(1)P15、P16真核表达载体的构建：根据p15、p16CDNA的核苷酸序列设计引物，在cDNA 两端分别引入限制性内切酶酶切位点，PCR 扩增，产物以琼脂糖凝胶电泳法鉴定并用试剂盒纯化回收，同时双酶切上诉产物与载体PcDNA3，将所得酶切片段与线性化载体混合，在连接酶的作用下得到两种连接产物：P C D N A 3 PIS 和P C D N A 3 PI6；取适量上述产物分矛转化感受态大肠杆菌 JMI 09，涂布含有氨芋青霉素的 LB平板。门）酶切鉴定阳性克隆：分别挑取上述方法鉴定出的阳性克隆加到适量的 u 培养液中过夜，碱裂解法制备质粒，双酶切鉴定。（）测序鉴定乡 果。3．细胞培养及稳定转化：人胆管癌细胞系QBC939fo胞用含 10仙小牛血清 DMEM、3 7”C、5％CO；培养；基因转染采用脂 质体（LIPofectamine 2000）法，48－门 小时后稀释传代，加入C－418 筛选稳定表达细胞株，2 8一 3 5 天在 尸 性克隆扩大培养；W e s t e r n一 hi 0 t鉴定转染结果；MTT 法测定细胞生长曲线，流式细胞光度术检测细胞周期，分析、比较结果。结果：1．p15、p16 阳性表达率在胆囊癌中分别为26．7人ZO．0％，在胆管癌中分另 为30．0％、ZO．0％Z 与肿 瘤的 、）－正文 南京医科大学博士学泣论文病理分期无关（P＞0．05）；二者的表达在胆囊癌中呈正相 关性（P＞O．05，r＝0．4 5 2）2．重组质粒的PCR法筛选结 果：在约464hp处显示单一 目 的条带的克隆为 P C D N A 3－PIS FR。11克隆；在 勺4 7 8 b P 处显示单一目的条带的克隆为 P c D N A 3－PI6 阳性克隆。酶切鉴定结果：电泳结果中有 4 6 4 b P与 4 7 8 b P片段的菌落即为阳性重组克隆。测序鉴定结果证明阅读框架正确。3western－blot 圭 果显示，含有pcDNA3p15、PCDNA3PI6 6 细胞 PI5、PI6 蛋白质水平显著高于对照组，表明外源基因已经在真核细胞内表达，成功获得P15、P16 高表达的细胞模型。生长曲线显示，P15、PI6 高表达的人胆管癌细胞与对照组细胞相比，生长速率均明显下降。流式细胞光度术结果显示，细胞周期中S 期f①胞在PI＼P16 高表达组均明显减少，与对照组比较，有显著性差异；两组之间相比较，NIJ显示细胞周期中分布上的差异。结论：1．抑癌基因 PI＼ PI6在胆囊癌、胆管癌组织石蜡标本中均呈低表达，并在胆囊癌中呈正相关性，提示D1〕P16 与胆道肿瘤的发生、发展密切相关。2．在人胆管癌细胞中高表达P15、P16抑癌基因均抑制了细胞的生长，并导致了较明显的G；期阻滞。3．P15 高表达组与P16 高表达组区别：前者不仅阻抑了人胆管癌细胞从G；期向s 期的过渡，也抑制了细胞由G；期向M期的进程，提示其在细胞周期的其他时相也发挥作用；而后者仅作用于G；期。