比较同胞脐血联合骨髓与外周血联合骨髓移植治疗重型β地贫的疗效和免疫重建

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ankailvyou
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目的 地中海贫血世界上最常见的遗传性溶血性血红蛋白病之一。β地中海贫血简称为β地贫,是由于β珠蛋白链的合成减少,导致α链相对增多,游离的α链形成α聚合体,在红细胞内沉淀,形成包涵体,导致无效造血及溶血。根据WHO的统计数据,全世界大约有1.5%的人携带有β地贫基因,我国以广东、广西、四川多见。临床缺乏治疗β地贫的有效手段,重型β地贫的患者需依赖输血及祛铁治疗来维持生命。疾病本身引起的反复溶血和长期的输血,导致患者体内铁过载,过多的铁沉积在肝脏、心脏和内分泌系统,导致内脏器官损害,死亡率高,危害极大。在发展中国家,由于血制品的缺乏、祛铁治疗的高昂费用及医疗保健体系的不完善,许多患者活不到20岁。异基因造血干细胞移植是目前治愈重型β地贫的唯一方法。骨髓移植是治疗重型β地贫最早也是最经典方法,年龄小、低危组、同胞供者的患者移植后无病生存率大都有80%~90%。与骨髓移植相比,外周血造血干细胞具有容易获得,造血重建快,感染发生率低,容易被供者接受等优点,但是外周血中含有较多的T淋巴细胞,移植物抗宿主病的发生率较高。与骨髓和外周血相比,脐血的优势在于获取方便、对供者无损伤、脐血移植后移植物抗宿主病发生的风险较小、HLA1~2位点不合也可以移植、病毒污染的风险低。但由于脐血中所含的造血干细胞数量少,存在着造血重建缓慢、移植物被排斥的风险,另外由于脐血中缺乏病原特异性记忆性淋巴细胞,对外来病原体的抵抗力弱,移植后免疫重建缓慢,容易发生机会性感染,是造成脐血移植相关死亡升高的主要原因之一。本研究拟通过对脐血联合骨髓与外周血联合骨髓移植治疗重型β地贫的造血和免疫重建结果进行比较,了解脐血移植后造血和免疫重建的规律,为改善脐血移植治疗效果提供临床和实验依据。方法1.临床资料分析 收集我院自2005年4月至2015年1月在我院接受同胞异基因造血干细胞移植的重型β地贫患者共154例,其中接受同胞脐血联合骨髓移植者74例,外周血联合骨髓移植80例。患者中位年龄为4(2~16)岁,男109例,女64例。所有患者均在我院经过地贫基因检查,基因型为β地贫纯合子或双重杂合子。154例移植患者Pesaro分度为Ⅱ~Ⅲ度。中位随访时间24(4~118)月。154例均为同胞供者,其中HLA配型全相合149例(97%),HLA配型1个位点不合者5例(3%)。ABO血型相合者103例(67%),主要不合29例(19%),次要不和22例(14%)。从移植前45~11天予羟基脲治疗。采用Bu+Cy+Flu+ATG预处理方案。CB+BM组的GVHD预防方案为:CsA ± MMF,PBSC+BM组的GVHD预防方案为:CsA+MTX+MMF。按照造血干细胞移植常规治疗,记录患者回输的总有核细胞数及CD34+细胞数,记录中性粒细胞和血小板植入中位时间,通过定期检测性别染色体或PCR扩增短串联重复序列了解嵌合状态,通过临床表现和实验室检查了解患者移植后是否出现aGVHD和cGVHD,机会性感染(如巨细胞病毒感染、细菌、真菌感染)、TRM等情况。使用SPSS17.0统计分析软件,用Kaplan-Meiers生存曲线和Log-Rank检验计算两组总生存率及无病生存率。2.流式细胞术分析 征得患者同意后分别于移植前、移植后1、3、6、12月收集CB+BM组和PBSC+BM组患者外周血标本。收集健康儿童外周血标本20例作为正常对照。采用流式细胞术分析方法,检测移植前和移植后1、3、6、12月患者外周血中T淋巴细胞亚群比例,根据血细胞分析仪得到白细胞数,计算出各个T淋巴细胞亚群细胞数的绝对值。使用SPSS17.0统计分析软件,采用非参数检验Mann-Whitney检验方法,对两组数据进行两两比较。全T淋巴细胞标志为CD3+,辅助T淋巴细胞为CD3+CD4+,初始CD4+T淋巴细胞为CD3+CD4+CD62L+CD45Ra+CD45Ro-,记忆CD4+淋巴细胞为CD3+CD4+CD45Ro+,细胞毒T淋巴细胞为CD3+CD8+,初始CD8+T淋巴细胞为CD3+CD8+CD45Ra+,记忆 CD8+T 淋巴细胞 CD3+CD8+CD45Ro+,调节性 T 淋巴细胞为 CD3+CD4+CD25+Foxp3+。3.T细胞受体谱系克隆性分析 收集患者外周血,使用人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离单个核细胞,提取RNA。收集CB+BM组和PBSC+BM组各5例患者,使用RT-PCR方法扩增其移植后1、3、6、12月的T细胞受体β链可变区24个亚家族,使用基因扫描方法了解其亚家族的克隆表达情况。结果1.154例患者中有153例(99.4%)获得植入,1例植入失败为CB+BM组患者。CB+BM组中性粒细胞植入中位时间为15(10~24)天,PBSC+BM组为11(8~16)天(P=0.009)。CB+BM组血小板植入中位时间为25(11~42)天,PBSC+BM 组为 16(11~39)天(P=0.000)。13 例(8.6%)患者出现混合嵌合状态,其中8例为CB+BM组,5例为PBSC+BM组(P=0.331)。CB+BM组仅有1例(1.4%)发生Ⅰ度aGVHD,PBSC+BM组共有17例(21.2%)发生 aGVHD(P=0.001),其中 4 例(2.6%)为 Ⅰ 度,6 例(7.5%)为 Ⅱ度,7 例(8.8%)为Ⅲ度。CB+BM 组有 1 例(1.4%)发生 cGVHD,为局限型,PBSC+BM组有6例(7.5%)发生cGVHD(P=0.034),均为广泛型。CB+BM 组 19 例(25.7%),PBSC+BM 组 30 例(37.5%)(P=0.115)发生出血性膀胱炎。CB+BM组8例(10.8%),PBSC+BM组6例(7.5%)(P=0.475)发生肝静脉闭塞病。CB+BM 组 21 例(28.4%),PBSC+BM 组 7 例(8.8%)(P=0.001)移植后发生 CMV 感染。CB+BM 组 8 例(10.8%),PBSC+BM 组 2 例(2.5%)(P 0.037)发生细菌/真菌感染。6例(6.5%)发生侵袭性真菌病,均为CB+BM 组(P=0.009)。CB+BM 组 18 例(24.3%),PBSC+BM 组 8 例(10.0%)(P=0.018)发生肺炎。共有10例患者(6.5%)因移植相关并发症死亡,其中CB+BM组9例,PBSC+BM 组 1 例(P=0.006),CB+BM 组 2 年 TRM 累计发生率为 12.3%,PBSC+BM 组 TRM 累计发生率为 1.3%(P=0.006)。共有143例患者存活,其中142人为无地贫生存,全体患者3年预期OS 为 92.9%,TFS 为 92%。CB+BM 组和 PBSC+BM 组 3 年 OS 分别为 86.3%和 98.8%(P=0.003);CB+BM 组和 PBSC+BM 组 3 年 TFS 分别为 86.3%和97.5%(P=0.011)。2.CB+BM组和PBSC+BM组移植后1、3、6、12月CD3+T淋巴细胞和CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量表现出相似的变化趋势。T淋巴细胞在移植后1月均呈下降趋势,随后逐渐恢复,在移植后12月,两组患者的CD3+T淋巴细胞绝对值恢复到移植前水平。CD4+T细胞在移植后1月出现明显的下降,随后缓慢恢复,但移植后12月未能恢复到移植前水平。CD8+T细胞在移植后1月出现明显的下降,随后恢复较快,移植后3月左右已经上升至移植前水平。移植后早期CD3+T淋巴细胞的扩增以CD3+CD8+T细胞为主,而CD3+CD4+T细胞明显低下,CD4+/CD8+比值倒置,在移植后12月CD4+/CD8+仅为 0.78±0.45。使用Mann-Whitney检验分别对两组患者移植前及移植后1、3、6、12月的T淋巴细胞亚群数量进行两两比较。移植后第3月PBSC+BM组MemCD8+细胞比CB+BM组明显增高,具体数值为757.00±826.87/μ L和266.67±92.92/μ L(p=0.043)。移植后 12 月 CB+BM 组的 TregT 细胞数量较PBSC+BM组高(p=0.033)。aGVHD对移植后1、3、6、12月T淋巴细胞亚群无明显影响。发生CMV再激活组移植后第1月和第12月的NavCD4+T淋巴细胞低于无CMV再激活组,具体数值为0.17±0.13/μ L和2.38±3.93/μ L(p=0.035);37.42±38.32/μ L 和 184.66± 160.89/μ L(p=0.003)。发生 CMV再激活组移植后第1月的MemCD4+T淋巴细胞显著低于无CMV再激活组(33.67±11.72/μ L 和 104.53±90.06/μ L,p=0.006)。发生 CMV 再激活组移植后第1月和第3月的Treg细胞低于无CMV再激活组(0.46±0.12/μL和 1.71±1.71/μ L,p=0.009;0.87±0.64/μL 和 3.46±3.79/μ L,p=0.007)。发生细菌/真菌感染组移植后6月的CD4+T细胞低于未发生感染组(296.83±85.58/μ L vs 483.46±290.45/μ L,p=0.008);发生感染组移植后1月MemCD4+T细胞和NavCD4+T细胞均低于未发生感染组(33.67± 11.71/μL 和 104.53±90.06/μ L,p=0.006,0.17±0.13/μ L 和 2.38±3.93/μ L,p=0.035);发生感染组移植后1月和3月的Treg T细胞均低于未发生感染组(0.46±0.12/μL 和 1.71±1.71/μ L,p=0.009;0.87±0.64/μL 和 3.46±3.79/μ L,p=0.007)。3.CB+BM组和PBSC+BM组各有5例患者移植后1、3、6、12月进行了TCRβ V亚家族基因谱系扫描。两组患者在HSCT后1年均能够完全表达TCRβ V24个亚家族基因,并且CB+BM组寡克隆率减少。CMV病毒再激活者表现出较多的TCR β V克隆谱系异常。结论1.脐血联合骨髓移植以及外周血联合骨髓移植均是治疗重型β地贫的有效方法。2.CB+BM组造血重建较PBSC+BM组慢、GVHD发生率低;CB+BM组CMV再激活、细菌/真菌感染较PBSC+BM组高,导致CB+BM组TRM发生率增高;CB+BM组OS和TFS低于PBSC+BM组。3.CB+BM组和PBSC+BM组移植后1、3、6、12月T淋巴细胞亚群数量表现出相似的变化趋势。移植后CD3+T淋巴细胞的扩增以CD3+CD8+T细胞为主,而CD3+CD4+T淋巴细胞明显低下,CD4+/CD8+比值倒置,在移植后12月仍未恢复;移植后第3月PBSC+BM组MemCD8+细胞比CB+BM组明显增高,CB+BM组移植后12月Treg T细胞数量较PBSC+BM组高。4.发生CMV再激活组和细菌/真菌感染组在移植后不同时点的NavCD4+、MemCD4+T淋巴细胞和Treg细胞低于无CMV再激活组和无感染组,提示移植后CD4+T淋巴细胞免疫重建缓慢是导致各种感染高发的主要原因。5.CB+BM组和PBSC+BM组在移植后均能较早较快地恢复TCRβ V24个亚家族谱系克隆。
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