番茄是新疆一种重要的特色经济作物，在新疆种植番茄具有得天独厚的优势。然而随着世界贸易的日益深入，番茄面临日趋严重的各种植物双生病毒的危害，而目前已有的技术方法难以在生产中实现番茄对多种双生病毒的广谱抗性。因此培育广谱抗双生病毒番茄品种具有重要意义。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速发展，已被用于植物抗病毒工程中。基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统的工作原理，要想实现广谱抗病毒育种，在不同病毒基因组序列上必须要有保守的、且符合guideRNA设计要求的靶序列。因此，本研究，通过在公共数据库中收集并分析了80种可以侵染番茄的双生病毒基因组序列，发现复制起始蛋白(Replication-initiator protein, Rep)在核苷酸序列上存在多处高度保守的序列，根据guideRNA设计原则，设计了一个具有一个PAM位点的guideRNA和一个具有两个连续PAM位点的guideRNA作为CRISPR/Cas9系统的靶序列，将该系统转化Micro-Tom番茄后，对其进行农杆菌介导TYLCV侵染性克隆病毒接种实验，以此研究以Rep蛋白基因保守序列设计的两种靶序列能否真正实现广谱抗病毒的效果。研究结果如下：
　　1．以双生病毒Rep蛋白基因保守序列设计的两种guideRNA为CRISPR/Cas9系统的靶序列，构建相应的CRISPR/Cas9基因编辑载体，并通过瞬时转化烟草，初步验证了靶序列抗病毒的有效性。
　　2．将带上述两种靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体转入番茄中，对阳性转基因番茄进行TYLCV-SH2侵染性克隆病毒接种实验，并通过qPCR方法检测转基因番茄的抗病毒效果，结果发现：带有单、双PAM靶序列编辑载体的转基因番茄材料并没有表现出明显的抗病性。表明单PAM的靶序列不能实现抗病毒效果，而双PAM的靶序列不能实现抗病毒效果的原因可能是由于CRISPR/Cas9编辑载体的双PAM靶序列与TYLCV-SH2侵染性克隆的靶序列有两个碱基的错配，这可能会影响CRISPR/Cas9系统与靶序列的结合，从而影响抗病毒的效果，因此进行了后续的定点突变实验。
　　3．通过定点突变PCR技术，将TYLCV-SH2侵染性克隆双PAM靶序列中错配的碱基，改造成我们前期设计的CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶序列，选择含有双PAM靶序列编辑载体的转基因番茄作为供试材料，进行突变后的TYLCV-mSH2侵染性克隆病毒接种实验，通过qPCR检测其抗病毒效果。结果发现：相比于转化Cas9-MCS的空载转基因番茄材料，含有双PAM靶序列编辑载体的转基因番茄材料的抗病效果依旧不明显。最终得出结论，以Rep蛋白基因保守序列设计的两种靶序列不能用于基于CRISPR/Cas9系统介导的番茄抗双生病毒育种研究中，要实现番茄广谱抗病毒效果，可能需要其他策略。