论文部分内容阅读
背景:山奈酚是一种天然的黄酮醇类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗凋亡等药理学活性,是一种安全并且有广泛应用前景的药物单体。淋巴细胞是一种重要的免疫细胞并且在免疫应答中发挥着不可替代的作用,关于淋巴细胞焦亡的文献大多与HIV病毒感染有关,暂时没有文献研究细胞焦亡与细胞活力之间的联系。目的:研究山奈酚对原代分离的淋巴细胞和LPS/ATP介导细胞焦亡模型下的淋巴细胞活力的影响,进一步结合细胞焦亡过程从蛋白和基因表达水平阐述其干预作用和机制。方法:分离小鼠脾脏淋巴细胞,用CCK-8法检测细胞活力,筛选山奈酚适宜的作用浓度和时间,再用流式细胞术检测山奈酚对细胞生长周期的影响,并用q RT-PCR方法检测相关细胞因子的表达变化。基于上述研究,用LPS/ATP建立焦亡模型,通过检测LDH的释放水平和PI-Hoechst染色情况评估细胞膜完整性,以及用Elisa法检测IL-1β和IL-18的释放。在此模型中,用山奈酚预处理细胞,研究药物对LPS/ATP介导焦亡细胞活力的改善以及干预机制,用Western Blot、q RT-PCR法检测细胞焦亡相关蛋白和基因的表达。结果:1.浓度为0.1-10μM山奈酚作用3-24h能够提高脾淋巴细胞活力,具有同有丝分裂原(Con A和LPS)类似的促增殖作用,并影响细胞周期中的S期和G2/M期,提高细胞分裂速度,同时影响细胞因子IL-10、TNF-α、IL-6和IFN-γ的基因表达。2.细胞焦亡模型的评价指标包括细胞活力、PI染色情况、LDH、IL-1β和IL-18释放水平,各模型组与空白组相比均有显著性差异。综合考虑选择100ng/ml浓度的LPS处理12h和1m M浓度的ATP处理4h作为焦亡模型。3.山奈酚对LPS/ATP介导的淋巴细胞焦亡有一定抑制作用,能够提高焦亡细胞的活力、减少细胞死亡率、改善焦亡细胞的异常形态,另外,LDH释放率和PI染色结果显示山奈酚减少细胞膜受损程度。进一步研究显示,山奈酚通过抑制细胞焦亡相关基因和蛋白实现对焦亡细胞的保护作用,包括抑制Caspase-1酶活性,抑制TLR4、NLRP3、Caspase-1的蛋白表达,阻止GSDMD的活化,抑制炎性因子IL-1β、IL-18的分泌,抑制IL-1β、IL-18、NLRP3的基因表达。结论:山奈酚能够提高脾淋巴细胞活力,在正常情况下,促进淋巴细胞增殖,加强机体的免疫应答;在LPS/ATP介导的焦亡模型下,对淋巴细胞活力的恢复有积极作用,并且山奈酚对焦亡细胞活力的影响和山奈酚干预细胞焦亡过程有关,提示山奈酚在一定程度上具有改善细胞焦亡的药理作用。本研究丰富了山奈酚的药效学作用,对临床上有关淋巴细胞的疾病的治疗有一定参考价值。