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研究背景:“脾藏意”出自《素问·宣明五气》,是五脏藏神理论的重要内容,为中医辨治神志病证奠定了丰厚理论基础,具有重要的理论意义和实践价值。目前“脾藏意”实验研究较少,对其科学内涵缺乏深入了解。“脾”何以藏“意”,如何更好地运用“脾藏意”相关理论指导临床实践成为了中医理论现代科学研究中面临的重要任务。研究目的:整理相关文献,研究“脾藏意”的理论内涵,分析“脾藏意”相关理论在健忘诊疗中的应用;并基于脾胃与肠道菌群的相关性设计实验,观察肠道菌群变化对脾胃功能状态和空间记忆能力的影响,从记忆角度研究“脾藏意”的现代科学内涵。内容与方法:本项研究主要涉及文献研究和实验研究两部分内容:第一部分为文献研究。采用文献研究法对脾藏意相关理论进行系统研究,分别从生理基础和病理表现的特点来阐释脾藏意的理论内涵;基于脾藏意主记忆的认识,从中医对健忘的认识和从脾胃论治健忘的理论基础进行理论探讨,并基于肠道微生态学研究前沿提出科学假说,为实验研究部分提供切入点和落脚点;第二部分为实验研究。基于脾胃与肠道菌群的相关性设计动物实验,从记忆角度对脾藏意的内涵进行初步探索。我们以高脂饮食暴露法建立aMCI大鼠模型,研究高指饮食暴露法建立aMCI大鼠模型所需的实验条件。分别以益生茵管理和温肌汤来调节高脂饮食诱发的aMCI大鼠的肠道菌群和脾胃功能状态,观察各组大鼠痰湿中阻证证候评分和空间记忆能力的差异性变化,研究肠道菌群变化对脾胃功能状态和空间记忆能力的影响,并根据大鼠海马组织/神经元的病理改变、LTP变化和神经调节因子表达差异研究其作用机制,通过分析温胆汤组和益生菌管理组肠道菌群的变化情况来分析温胆汤能否通过调节肠道菌群发挥对高脂饮食诱发aMCI的防治作用。研究结果:1.文献研究脾藏意之“脾”是结构和功能的高度统一,脾藏意之“意”是对记忆、思维、注意和意志等神志活动中具有土象生化、承载等特性的心理过程的概括。脾胃为人体气血生化之源,气机升降之枢,具土象“中和”之德,司职“谏议”,故脾胃能够主持并调节神志活动。健忘是一类以记忆力减退,遇事善忘为主要临床表现的病证。脾藏意主记忆,脾胃主司记忆的形成过程,记忆失常当责之于脾胃。健忘与衰老相关,人之衰老始于脾胃,健忘的发生发展与脾胃功能衰退之间存在必然的因果联系。此外,脏腑失调、气血失和也是导致健忘的重要因素,脾胃与其密切相关,因此“重中”思想贯穿于健忘治疗的各个环节。肠道菌群具有复杂的生化特性,广泛参与了宿主的各项心生理活动,记忆活动是其中之一。由于肠道菌群与中医脾胃密切相关,可以从一定程度上反映脾胃的功能状态,我们认为“肠道菌群可能是脾藏意的生物学基础之一”,并设计实验进行初步验证。2.实验研究2.1高脂饮食暴露法建立痰湿中阻型aMCI大鼠模型研究:A.痰湿中阻证中医证候评分:与标准饲料暴露相比,45%中高脂饲料暴露60天大鼠的痰湿中阻证中医证候评分升高(p<0.05);60%超高脂饲料暴露30天和60天大鼠的痰湿中阻证中医证候评分均显著升高(p<0.01)。B.空间记忆能力:与AIN93标准饲料暴露相比,60%超高脂饲料暴露60天目标象限游泳时间显著降低(p<0.05)。2.2益生菌管理/温胆汤对痰湿中阻型aMCI大鼠的影响及机制研究:A.痰湿证中医证候评分:与标准对照组相比,高脂对照组大鼠的痰湿证中医证候评分升高(p<0.01);与高脂对照组相比,低剂量组和中剂量组痰湿中阻证中医证候评分无显著差异(p>0.05),高剂量组大鼠的痰湿中阻证中医证候评分降低(P<0.05),温胆汤组大鼠的痰湿中阻证中医证候评分显著下降(p<0.01)。B.空间记忆能力:与标准对照组相比,高脂对照大鼠目标象限游泳时间减少(p<0.05);与高脂对照组相比,低剂量组和中剂量组目标象限游泳时间无显著差异(p>0.05),高剂量组大鼠目标象限游泳时间增加(p<0.05),温胆汤组大鼠目标象限游泳时间显著增加(p<0.01)。C.病理学观察:a.HE染色:各组大鼠海马CA1区与DG区神经元数量丰富、形态结构基本正常、排列规则,HE染色未见明显异常,各组之间无显著差异。b.甲苯胺蓝染色:标准对照组大鼠海马组织中尼氏小体数量丰富,深染,呈斑块状分布。高脂对照组大鼠海马组织中尼氏小体数量较少,染色变浅。高剂量组和温胆汤组大鼠海马组织中尼氏小体数量较丰富,染色加深。c.海马组织神经元超微结构:标准对照组大鼠海马组织神经元形态基本正常,结构基本完整,细胞器丰富,细胞质基质未见明显异常。高脂对照组大鼠海马组织神经元呈重度水肿,细胞质基质和细胞器数量明显减少,多呈坏死、崩解状态。高剂量组大鼠海马组织神经元细胞呈中度水肿状态,胞内细胞器丰富,但不同程度肿胀。温胆汤组大鼠海马组织神经元呈中度水肿,细胞器较丰富,并呈不同程度肿胀。d.海马组织突触超微结构:标准对照组大鼠突触突触结构完整,致密区相对较厚,突触间隙狭窄,突触小泡丰富;高脂对照组大鼠突触重度水肿,结构不清晰,突触间隙增宽,突触小泡较少;高剂量组大鼠突触呈中度水肿,突触间隙略增宽,突触小泡丰富;温胆汤组大鼠突触中度水肿,突触间隙略增宽,突触小泡较丰富。D.海马CA3-CA1区LTP:与标准对照组相比,高脂对照组大鼠在HFS诱导后fEPSP斜率降低(p<0.05);与高脂对照相比,高剂量组益生菌大鼠在HFS诱导后fEPSP斜率显著升高(p<0.01),温胆汤组大鼠在HFS诱导后fEPSP斜率升高(p<0.05)。E.神经调节因子表达情况:与标准对照组相比,高脂对照组大鼠海马组织BDNF、CREB和SYP的表达水平均降低(p<0.01或pp<0.05);高剂量组BDNF和CREB的表达水平升高(p<0.05),SYP无显著变化(p>0.05);温胆汤组大鼠海马组织BDNF(p<0.01)、CREB和SYP(p<0.05)的表达水平均升高。F.肠道菌群变化情况:与标准对照组相比,高脂对照组Chaol指数和Observed species指数显著下降(p<0.01);与高脂对照组相比,高剂量组Chaol指数和Observed species指数显著升高,温胆汤组Chaol指数和Observed species指数升高(p<0.05或p<0.01)。物种相对丰度分析显示,与标准对照组相比,高脂对照组大鼠Bacteroides菌属相对丰度降低,而Blautia菌属和Clostridium XlVb菌属和Paraprevotella菌属相对丰度升高;高剂量组和温胆汤组Bacteroides菌属相对丰度升高,Blautia菌属、Clostridium XlVb菌属和Collinsella菌属等相对丰度降低,变化趋势相似。OTU分析显示,与标准对照组,高脂对照组大鼠肠道菌群菌群物种组成存在明显差异;高剂量组和温胆汤组大鼠肠道菌群物种组成与标准对照组接近。结论:1.文献研究脾藏意是指脾胃对神志活动中记忆、思维等心理过程的主持和调节作用。脾胃纳运水谷,斡旋气机,能为神志活动提供必要的生理基础;脾胃又具土象“中和”之德,司职“谏议”,可助心君成其神明之用,故脾能藏意。脾藏意是五脏藏神理论的重要内容,是中医从脾胃论治健忘等神志病证的理论基础。2.实验研究(1)60%超高脂饲料暴露60天能够引起脾胃损伤,学习记忆障碍,成功建立痰湿中阻型aMCI大鼠病证结合模型。(2)高剂量益生菌管理可以调节肠道菌群,显著降低高脂饮食大鼠的痰湿中阻证中医证候评分,改善其脾胃功能状态,并能通过调节BDNF和CREB的表达,促进神经元修复和生长,提高长时程突触可塑性等方式改善高脂饮食大鼠的空间记忆能力。可见肠道菌群与脾胃密切相关,能够从一定程度反映脾胃的功能状态,是脾藏意的生物学基础之一。(3)温胆汤可以调理脾胃,降低高脂饮食大鼠的痰湿中阻证中医证候评分,并通过调节BDNF、CREB和SYP的表达,促进神经元细胞修复和生长,提高海马组织长时程突触可塑性,进而改善高脂饮食大鼠的空间记忆能力。温胆汤组大鼠肠道菌群的变化趋势与高剂量益生菌管理组接近,说明调节肠道菌群是温胆汤防治高脂饮食诱发的aMCI药效机制的关键环节之一。