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目的:1.通过观察大鼠坐骨神经慢性压迫模型(chronic constriction ofsciatic nerve,CCI)脊髓水平小胶质细胞OX-42(小胶质细胞特异表达补体受体-3的单克隆抗体)的表达,研究小胶质细胞对周围神经损伤的反应及其被激活的时程变化;2.观察米诺环素对大鼠脊髓水平小胶质细胞OX-42表达的影响,探讨小胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用及可能机制;3.米诺环素已被证实具有神经保护作用,通过本实验可以观察其对神经病理性疼痛的影响,从而为此药以后的临床应用提供科学依据。方法:(1)模型的建立:根据Bennett-Xie的描述结扎左坐骨神经,将Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组大鼠建立试验模型。用von Frey filaments测量大鼠损伤侧足底对机械刺激的缩足阈值,评价慢性神经损伤模型是否成功。行为学方法测试缩足阈值确定成功的模型,纳入实验。在10%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔内注射麻醉下,在大鼠左侧大腿后中部切开1.5-2.0cm的纵向切口,钝性分离股二头肌。将大约5-7mm长的坐骨神经从周围粘连组织中游离,在手术显微镜20倍视野下,首先暴露坐骨神经干,用4-0铬制肠线在其三叉分叉部的近端环绕神经干分别做4个轻度接扎环,间距为1.0mm,结扎强度以引起大鼠小腿肌肉轻度颤动为宜。伤口以生理盐水冲洗,以4-0丝线缝合筋膜和皮肤。对假手术组大鼠除了神经结扎,进行同样手术。所有手术步骤都在无菌环境下操作。(2)试验分组:70只大鼠被随机分成5组,Ⅰ组,正常对照组(n=10);Ⅱ组,假手术组(n=15);Ⅲ组,CCI预先给药组(予米诺环素40mg/kg,术前1小时给药,以后每天给药直至术后15天,n=15);Ⅳ组,CCI术后给药组(于神经病理性疼痛模型建立后再予米诺环素40mg/kg,至术后第15天,n=15);Ⅴ组,CCI生理盐水组(于神经病理性疼痛模型建立后予同剂量的生理盐水,n=15),均在每次动物行为学实验前15小时给药或生理盐水。(3)行为学测试:用足底触觉测量仪(中国医学科学院生物医学工程研究所),采用up-and-down的方法测定大鼠后爪50%缩足阈值,将被测大鼠被置于底面有网空的塑料盒子中,在实验开始前让其适应环境至少30分钟。依次使用标有刻度的纤毛(0.45,0.70,1.20,2.00,3.63,5.50,8.50,15.10 g)以足够的的力度垂直刺激后爪,使得纤毛弯曲6秒钟。大鼠出现敏锐地回缩反应或是出现缩腿被认为是阳性反应,若大鼠没有出现此阳性反应,则选择其上的一个较大刻度的纤毛刺激后爪;若出现阳性反应,则选择其下的一个较小刻度的纤毛刺激后爪。依此类推,直至发现分别可诱发缩腿反应或无缩腿反应相邻的两个刺激强度后,继续依序刺激4次,包括前面的2次,共6次刺激。每次试验重复二或三次,每次间隔约两分钟,取其平均值记为50%缩足阈值。若需要使用的力度超过15.10 g或低于0.45 g,该阈值直接记为15.00 g或0.25 g。50%缩足阈值的计算使用公式为:10lg(x)+kδ(X为最后刺激使用的力度;k为不同刺激方式的系数,δ是指各刺激力度(g)相邻间距的平均值,δ=0.224)。术前至术后15d每日测定术侧后爪50%缩足阈值。(4)测定OX-42的实验方法:各实验组动物于术后7、11、13、14、15天,分别于每个时间点随机取出3只大鼠,在10%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔内注射麻醉下,用含40g/L多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将其在灌流固定后,取出与坐骨神经相连的脊髓节段(腰骶膨大)进行石蜡包埋,连续冠状切片。切片进行抗OX-42的免疫组织化学实验并用3,3,一二甲基联苯胺(DAB)显色。光镜下观察脊髓切片并应用软件检测OX-42阳性细胞灰度值。结果:(1)从第Ⅴ组大鼠我们可以观察到,术前、术后第7天、第11天、第13天、第14天、第15天50%缩足阈值分别为13.30±1.71g,2.66±0.46g,2.89±0.34g,2.83±0.48g,2.41±0.228g,2.75±0.36g,可见,此组大鼠的神经病理性疼痛于术后第7天出现,于术后第14天最明显,并持续至试验结束。(2)将第Ⅱ组和第Ⅰ组各时间点的50%缩足阈值相比较,两者之间差异无显著性(P>0.05)。(3)将第Ⅲ组和第Ⅰ组各时间点的50%缩足阈值相比较,两者之间差异无显著性(P>0.05)。(4)将第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组各时间点的50%缩爪阈值作比较,第Ⅴ组<第Ⅳ组(P<0.05),第Ⅳ组<第Ⅲ(P<0.05),表明此三组在疼痛程度上的差异,此三组大鼠50%缩足阈值的大小依次为:第Ⅴ组<第Ⅳ组<第Ⅲ组。(5)免疫组织化学实验结果显示:第Ⅴ组术后7天,小胶质细胞的反应由静息状态变为早期反应状态,OX-42深染,细胞形态基本清楚,体积较小;术后11天,OX-42明显深染,OX-42阳性细胞无论在数量还是在体积上均达到高峰,细胞形态清楚并呈“丰满”状;术后13天,OX-42深染,OX-42阳性细胞有减少的趋势,细胞形态清楚;术后14天,小胶质细胞反应逐渐减弱,OX-42染色变浅,阳性细胞数量逐渐减少,细胞形态稍有模糊;术后15天,小胶质细胞反应进一步减弱,OX-42浅染,阳性细胞数量逐渐减少,细胞形态变得模糊。表明,小胶质细胞的激活在术后早期出现,于术后第11天最明显,之后有减弱的趋势。(6)OX-42阳性细胞平均灰度值测定结果显示:第Ⅰ组正常大鼠脊髓对应部位OX-42阳性细胞平均灰度值为157.41±5.40。从第Ⅴ组我们可以观察到:OX-42阳性细胞平均灰度值于术后第7天明显低于正常大鼠(P<0.05),术后第11天达到最低值,之后有上升趋势。术后7天平均值为121.62±6.67,术后11天平均值为115.47±6.12,术后13天平均值为118.58±6.40,术后14天平均值为119.35±4.71,术后15天平均值为121.08±4.42,以上结果表明第Ⅴ组OX-42阳性细胞平均灰度值显著低于第Ⅰ组(P<0.05)。结论:(1)在CCI大鼠模型中,脊髓小胶质细胞在神经病理性疼痛的早期被激活,第11天达高峰,之后呈现减弱趋势。(2)米诺环素术前给药能通过抑制小胶质细胞的激活从而抑制神经病理性疼痛的出现。但是在神经病理性疼痛模型建立后,米诺环素只能部分缓解神经病理性疼痛。