背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多发性疾病,是目前人类致死和致残的主要原因。AS的病理改变以动脉内脂质沉积,粥样斑块形成及伴随的炎症反应为特征,造成血管部分或完全堵塞进而导致心、脑、肾等多器官缺血、梗死,给人类健康造成极大的危害。大量研究已经表明不同动脉间发生动脉粥样硬化的程度存在差别,其中冠状动脉较易发生粥样硬化,而内乳动脉(internal mammary artery,IMA)粥样硬化发生率较低。正是这种差别的存在,使得内乳动脉成为了冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)左前降支首选的替代血管。目前已有研究表明:在冠脉搭桥手术后20年,IMA通畅率仍可大于90%。故此,内乳动脉的这种血管特性已成为当前研究的热点。然而,目前这种血管特性的机制还没有完全阐明。睾丸相关转录因子(testis derived transcript,TES)基因是近年来新发现的基因,其定位于人体染色体7q31.2上,编码一个含421个氨基酸的蛋白质(testin)。testin是一种细胞骨架蛋白,主要分布于黏着斑和细胞间连接的区域,可以与一系列细胞骨架蛋白结合。目前研究普遍认为TES基因是一种抑癌基因。2012年Archacki等人首次研究了TES基因与动脉粥样硬化的关系,他们发现TES基因在IMA的表达高于冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD),并且冠心病患者LAD的TES基因表达低于非冠心病者。然而,TES基因在AS发生发展过程中起到何种作用及其相应的分子生物学机制目前尚不明确。通过比较内乳动脉与冠状动脉形态学及分子学的差异从而寻找影响动脉粥样硬化发生发展过程中的关键因素可能成为揭示动脉粥样硬化发生机制的非常重要的思路和方法,从而为防止动脉粥样硬化发生发展提供新的手段。目的:本课题旨在通过比较TES基因在正常兔内乳动脉和冠状动脉间的表达,以及其在高脂喂养3个月后兔内乳动脉和冠状动脉间的表达,明确TES基因在内乳动脉与冠状动脉间的血管差异及对高脂的应答差异中的作用。同时进行原代内皮细胞培养,明确两种来源内皮细胞表达TES的情况。通过在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)过表达TES基因和下调TES基因,观察TES基因对内皮细胞功能的影响,阐明TES基因与动脉粥样硬化的关系及其可能的机制,为动脉粥样硬化的研究提供新的思路和靶点。方法:1.应用H-E染色法观察正常家兔内乳动脉和冠状动脉管壁形态,分别用RT-PCR、Real-Time PCR、Western blotting和免疫组化等方法从m RNA、蛋白及组织三个水平检测TES基因在内乳动脉和冠状动脉中的表达情况。同时,用酶消化法分离正常家兔内乳动脉和冠状动脉的内皮细胞进行原代细胞培养,采用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blotting等方法比较这两种来源不同的内皮细胞TES基因表达的差别。2.通过高脂饲养兔12周建立动脉粥样硬化模型,用H-E染色法观察内乳动脉和冠状动脉管壁形态,分析评估两种血管动脉粥样硬化的发生情况,同时采用RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting等方法从m RNA及蛋白等水平比较高脂喂养前后内乳动脉与冠状动脉中TES的表达差异。3.选取HUVECs,通过构建过表达TES的质粒和sh RNA干扰下调TES的质粒,利用慢病毒转染技术构建TES基因过表达和下调表达的HUVECs,研究TES基因对内皮细胞的生长、增殖、黏附、迁移和调亡等生物学行为的影响以及对动脉硬化相关基因的影响,探讨TES影响细胞功能可能的分子生物学机制。结果:1.正常家兔内乳动脉与冠状动脉解剖血管走行显示,内乳动脉主干为横向走行,沿途分叉较少;而冠脉走行于心脏的表面,其分支较多,远端走行于心肌内,与心肌结合较为紧密。组织H-E结果显示:二者血管壁结构大体可分为三层,分别为内膜层、中膜层和外膜层。在结构上比较,内乳动脉中膜层含较多弹力纤维,冠脉则以平滑肌细胞为主,余结构二者无明显差异。免疫组化结果表明:TES基因主要表达在兔内乳动脉和冠状动脉的内皮层。RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting结果显示:正常家兔内乳动脉TES基因的表达量高于冠脉的表达量(P<0.05)。TES基因在兔内乳来源的内皮细胞及冠脉来源的内皮细胞中均有表达,且内乳来源的内皮细胞的表达量高于冠脉来源的内皮细胞(P<0.05)。2.高脂喂养3月后,与正常组家兔相比,高脂组家兔血脂明显升高,体重明显增加,且冠状动脉发生粥样硬化的比率高于内乳动脉(P<0.05);高脂喂养3月后,家兔内乳动脉组织TES基因的表达量高于冠状动脉组织(P<0.05)。与正常组相比,高脂喂养组内乳动脉组织的TES表达量升高,冠状动脉组织TES的表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.成功构建过表达TES基因重组质粒305-TES和TES sh RNA下调质粒sh RNA-TES1/TES2并用慢病毒感染人脐静脉内皮细胞,成功建立TES过表达及TES下调的HUVECs。(1)选取过表达TES的HUVECs和对照组细胞,进行细胞生长曲线的描绘和MTT增殖实验,结果显示:过表达TES的HUVECs,其生长速度和增殖较对照组没有明显变化(P>0.05)。细胞粘附实验结果显示,与对照组相比,过表达TES基因致HUVECs胞黏附能力下降;应用人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)与过表达TES的HUVECs进行共粘附实验,结果显示,其与单核细胞的共黏附能力亦下降;与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕愈合实验结果显示,305-empty组细胞迁移较对照组增强(P<0.05)。应用Hoechst33258染色液对过表达TES基因的HUVECs的凋亡能力进行分析,结果表明过表达TES基因不影响细胞凋亡。应用实时定量PCR对过表达TES基因的HUVEC与对照组细胞的血小板-内皮细胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1,CD31)、单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、P-选择素(P-selectin)、基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)、一氧化氮合酶-3(nitric oxide synthase-3,NOS-3)以及凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1,LOX-1)的m RNA水平进行了检测。结果显示,PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-Κb、TM、v WF、TFPI、NOS3、LOX-1较对照组细胞表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);MCP-1、MMP-2较对照组细胞表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);ICAM、P-selectin较对照组细胞表达水平无差异(P>0.05)。(2)选择下调TES的HUVECs和对照组细胞,进行细胞生长曲线的描绘和MTT增殖实验,结果显示:下调TES表达的人脐静脉内皮细胞,其生长速度和增殖较对照组没有明显变化(P>0.05)。细胞粘附实验结果显示,与对照组相比,下调TES基因表达致HUVECs黏附能力增加;应用单核THP-1细胞与下调TES的HUVECs进行共粘附实验,结果显示,其与单核细胞的共黏附能力亦增加;差异有统计学意义(P<0.05)。划痕愈合实验结果显示,sh RNA-control组与sh RNA-TES1、sh RNA-TES2组在0h时,划痕距离大体相同。sh RNA-TES组细胞迁移较对照组下降(P<0.05)。应用Hoechst 33258染色液对下调TES基因的HUVECs的凋亡能力进行分析,结果表明下调TES基因表达不影响内皮细胞凋亡。同样,对下调TES基因的HUVECs与对照组细胞进行了动脉粥样硬化相关基因m RNA水平的检测。结果显示,PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-Κb、TM、v WF、TFPI、NOS3、LOX-1较对照组细胞表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);MCP-1、MMP-2较对照组细胞表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);ICAM、P-selectin较对照组细胞表达水平无差异(P>0.05)。结论:TES基因可能参与内乳动脉的抗动脉粥样硬化的过程。其可能是通过抑制内皮细胞与单核细胞的粘附以及增加内皮细胞的迁移能力来发挥抗动脉粥样硬化发生的作用。同时并不影响内皮细胞的生长、增殖和凋亡。此外,TES基因可以调节内皮细胞内多种基因表达变化,其影响细胞功能的途径可能是多样的。