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烟草(Nicotiana tabacum)是我国重要的经济作物之一,优质烟叶的生产对提高国民经济具有重要的意义。酚类物质的种类及其含量与烟叶品质密切相关。酚类物质的产生主要来源于苯丙烷代谢途径,该途径是植物体内重要的次生代谢途径,还涉及到黄酮类、木质素类以及芪类等次生代谢产物的生成,这些次生代谢物在植物提高自身品质和抵御外界胁迫伤害方面具有重要的作用。而MYB转录因子在植物苯丙烷类次生代谢、响应逆境胁迫以及其他生理活动方面具有重要的调控作用。因此,克隆调控苯丙烷次生代谢相关的MYB转录因子,并研究其调控机制对于提高烟草品质和抗逆性具有十分重要的意义。本研究以实验室前期研究发现的一个在优质烟草杂交种及其亲本中差异表达的MYB转录因子的EST序列为基序,采用RACE技术克隆该MYB的c DNA全长,分析其序列结构和亚细胞定位;构建过表达载体和CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化获得转基因植株,以鉴定该MYB转录因子在苯丙烷类物质合成及响应非生物胁迫方面的调节的功能,为深入研究该基因的分子调控机制及培育优质多抗烟草新品种提供依据和基因资源。主要研究结果如下:1、以在优质烟草杂交种及其亲本中差异表达的一条MYB转录因子的EST序列为基序,利用RACE技术从烟草叶中克隆了该MYB基因,命名为Nt MYB4a(Gen Bank登录号为MN178131)。该基因c DNA全长为816 bp,编码271个氨基酸,并具有2个典型的MYB结构域和35个磷酸化位点,亚细胞定于细胞核、细胞膜和细胞质。Nt MYB4a的氨基酸序列与林烟草Nicotiana sylvestris(XP＿009798928.1)预测的MYB4类蛋白同源性最高,为99.64%,与野生烟草Nicotiana attenuata(OIT38711.1)已经确定的MYB4同源性为77.69%。系统进化树分析发现Nt MYB4a与野生烟草MYB4的亲缘关系比较近,且与枇杷Ej MYB1和拟南芥At MYB14等转录激活型因子聚为一类。2、构建Nt MYB4a过表达载体和CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化获得转基因植株,以鉴定Nt MYB4a的功能。结果显示,与野生型烟草相比较,Nt MYB4a在过表达植株中超量表达,花青素合成相关酶基因PAL、C4H、4CL、DFR和ANS的表达均上调,花青素含量上升65%,花色加深;Nt MYB4a在敲除突变株中表达下调,花青素相关酶基因均下调,花青素含量下降55%,花色变浅。酚类物质含量检测发现,过表达植株中的酚类物质含量高于野生型,其中茎、叶和花中绿原酸含量分别较野生型提高1.24、2.71和2.15倍;敲除植株的酚类物质总量及绿原酸含量均小于野生型。过表达植株茎、叶和花中涉及绿原酸合成途径的相关酶基因PAL、C4H、4CL、HCT的表达均上调,其中HCT上调幅度最大;而在敲除植株茎、叶、花中却都下调,说明Nt MYB4a基因可能通过调节绿原酸合成相关酶基因的表达,从而促进绿原酸的合成。3、对不同发育时期不同部位的烟草组织进行主要酚类物质的测定和Nt MYB4a的表达分析,结果表明,Nt MYB4a在烟草不同时期的各个组织中均有表达,盛花期以前Nt MYB4a主要在根中表达,成熟期则主要在中部叶中表达。酚类物质含量测定发现,绿原酸含量以苗期最高,且以根中含量较高,随着生育期推进,绿原酸含量开始下降,成熟期则以中部叶较高,根中较少。相关性分析表明Nt MYB4a的表达量与绿原酸含量存在正相关关系,表明Nt MYB4a可能对烟草中绿原酸的合成有正向调控作用。4、Nt MYB4a的表达受低温(4℃)、PEG、Me JA、Na Cl、ABA和黑暗处理的诱导,但表达模式因胁迫类型不同而不同。Nt MYB4a基因在低温、Na Cl、PEG、Me JA和黑暗诱导后表达量均表现出显著性上调变化,其中以低温、Me JA诱导作用最为明显;而在ABA胁迫下该基因的表达量无明显变化,推测Nt MYB4a基因的转录调控很可能不依赖于ABA信号传导途径。在低温、PEG和Me JA胁迫下,Nt MYB4a的表达在过表达植株中受影响较小,脯氨酸含量较高,丙二醛含量较低,而敲除植株中Nt MYB4a的表达量变化波动较大,有时显著高于,有时低于野生型中的表达量,脯氨酸含量较低,丙二醛含量较高。这些结果表明:Nt MYB4a基因是PEG、低温和Me JA等非生物胁迫的应答基因。