近年来由副溶血性弧菌引起的食物中毒以及人群暴露规模呈明显的上升趋势,已经超过沙门氏菌,成为我国首要的食源性致病菌。因此加强对食品中副溶血性弧菌的防控,开发快速、准确的检测技术十分必要。目前针对副溶血性弧菌的实验室检测方法存在检测周期长、特异性差、灵敏度低及操作繁琐等缺点,难以满足快速检测的需求。所以建立一种快速、简便、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌检测方法,对加强食源性疾病的预防和控制具有重要意义。本课题利用免疫磁珠分离技术和量子点荧光标记技术,依据抗原抗体特异性反应的原理,通过免疫磁珠上的抗体与样品中目标菌的特异性结合,从样品中富集分离目标菌,再利用量子点荧光生物探针进行标记,得到免疫磁珠-目标菌-量子点探针“三明治”夹心复合物,利用荧光分光光度计对得到的复合物荧光强度进行检测,从而建立一种基于免疫磁分离技术和量子点荧光标记技术的副溶血性弧菌快速检测方法。1.功能化Fe₃O₄粒子的制备和表征本实验首先通过水热合成法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子,然后采用微乳液法制备Tween-20修饰的Fe₃O₄聚集体,经过St?ber法在其表面包覆硅壳,得到Fe₃O₄@Si O2磁性纳米复合粒子,最后利用高聚反应在Fe₃O₄@Si O2表面修饰羧基,制备功能化Fe₃O₄粒子。采用透射电镜、红外光谱、Zeta电位和磁强计对所合成的磁纳米粒子的结构和性质进行表征。结果显示,合成的功能化Fe₃O₄磁性纳米粒子为球形,平均粒径为217 nm,且具有良好的分散性。功能化Fe₃O₄粒子在红外光谱1714.753 cm-1处呈现羧基的伸缩振动峰,表明羧基被成功修饰到Fe₃O₄@Si O2复合粒子的表面;随着磁性粒子的包覆与修饰,在p H值为7时,粒子的电位值由-17 mv（Fe₃O₄）降至-36 mv（Fe₃O₄@Si O2）,并最终降至-46.8mv（Fe₃O₄@Si O2-COOH）,表明Si O2与羧基成功被修饰到了功能化Fe₃O₄粒子的表面。随着粒子壳层的包覆增加,粒子的饱和磁化率由60.586 emu/g（Fe₃O₄）降至40.572 emu/g（Fe₃O₄@Si O2）,并最终降至21.264 emu/g（Fe₃O₄@Si O2@st）,但仍具有良好的磁响应能力。2.免疫磁珠的制备及其对副溶血性弧菌富集效率的检测将所制备的表面含有羧基的功能化Fe₃O₄粒子及1μm和180nm商品化羧基磁珠分别与副溶血性弧菌多克隆抗体IgG进行偶联,制备可富集并分离副溶血性弧菌的免疫磁珠,并评价所制备的功能化Fe₃O₄粒子对副溶血性弧菌的富集效果。利用平板计数法对富集前后样品中菌含量的测定计算免疫磁珠的富集效率,确定下一步实验磁珠的选用。结果显示,三种磁珠对副溶血性弧菌的富集效率为合成磁珠（28.57%）<180 nm磁珠（41.43%）<1μm磁珠（57.14%）。合成磁珠对副溶血性弧菌的捕获效率较低,可能是由于其表面羧基修饰量不足以及聚苯乙烯的蓬松多孔结构所致。因此本实验选用1μm及180 nm商品化磁珠进行下一步的检测工作。3.副溶血性弧菌检测方法的建立与评价分别将两种商品化磁珠与副溶血性弧菌多克隆抗体IgG相偶联制备免疫磁珠,将功能化量子点与鸡卵黄抗体Ig Y相偶联制备可识别副溶血性弧菌的量子点荧光生物探针。在检测时,依据抗原抗体特异性反应的原理,向待检样品中加入所制备免疫磁珠,从而富集并分离出目标菌,然后加入量子点荧光生物探针进行特异性标记,得到“免疫磁珠-目标菌-量子点”三明治夹心结构的复合物。利用荧光分光光度计对复合物的荧光强度进行测定,通过荧光强度与菌液浓度的线性关系,实现对副溶血性弧菌的定量检测。通过对两种商品磁珠偶联IgG的用量、免疫磁珠的用量、富集时间、量子点偶联Ig Y的用量、量子点荧光生物探针的用量以及标记时间进行优化,建立了一种副溶血性弧菌快速检测方法,并且对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行评价,并用所建立的检测方法对人工模拟样品进行检测。结果显示,所建立的副溶血性弧菌检测方法最佳反应条件为:1μm和180 nm磁珠偶联IgG最佳用量分别为100μg和30μg;两种免疫磁珠最佳用量分别为50μL及40μL;两种磁珠的最佳富集时间分别为60 min及90 min;功能化量子点偶联Ig Y最佳用量为12μg/μL;量子点荧光生物探针的最佳标记时间均为90 min;量子点荧光生物探针的最佳用量分别为300μL及400μL。利用这两种磁珠所建立的检测方法对副溶血性弧菌的最低检测限均能达到102CFU/m L,且具有良好的线性关系;平均加标回收率分别为90.61%和95.26%,准确度较好;不与志贺菌、大肠杆菌O157:H7、布鲁氏菌发生交叉反应,特异性较好;两种磁珠建立的检测方法的日内、日间变异系数分别为4.03%⁷.41%、2.03%⁷.83%、3.30%⁶.09%、2.75%⁵.53%,均小于10%,说明该方法的重复性较好;两种磁珠建立的检测方法对模拟样品的检测结果显示对目标菌的最低检测限均可达到102cfu/m L,说明该方法可以用于检测模拟样品中的副溶血性弧菌。综上所述,本课题建立了一种基于免疫磁珠分离和量子点荧光标记的副溶血性弧菌快速检测方法。该检测方法的检测限较低,特异性较好,且具有较好的稳定性,为副溶血性弧菌的快速检测奠定基础。