急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是CHD的特殊疾病谱,包括UAP、STEMI、NSTEMI和猝死。研究表明,ACS的发生机制是由于冠状AS斑块不稳定,即AS斑块糜烂、溃蚀、破溃或破裂并发血栓形成、血管收缩、血管栓塞导致的急性或亚急性心肌缺血和或坏死所致。不稳定斑块有其显著的组织学特点,即较薄的纤维帽覆盖着富含脂质的脂质池,脂质池内有活化的炎性细胞,如巨噬细胞和T淋巴细胞浸润,活化的炎症细胞及其释放到全身或局部的细胞因子通过激活内皮细胞、触发斑块破裂、启动血栓形成,从而诱发ACS。近年来研究发现,ACS患者AS斑块的不稳定是体内特异性炎症、非特异性炎症反应以及特异性细胞介导的免疫反应增强,并进一步诱发血管损伤的结果。大量炎症相关细胞参与了这一过程,其中T淋巴细胞发挥了核心作用,ACS的发生发展具体机制尚未明了。目前观点认为,机体针对循环中和或AS斑块内的慢性抗原产生持续免疫,机体对慢性抗原的持续免疫可以引起免疫系统的衰老和重构,特别是T淋巴细胞出现亚群组成改变以及衰老T淋巴细胞功能多样性,表现为初始T淋巴细胞减少和寡克隆TCR记忆性T淋巴细胞增殖,同时特异性短寿的CD28~+T淋巴细胞向长寿的CD28~-的衰老T淋巴细胞转变,这些衰老的CD28~-T淋巴细胞CD28分子表达下调,而新生表达天然杀伤细胞受体(NKRs)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)等细胞表面分子,从而出现异常功能。研究发现在外周血或AS斑块均可发现CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖,与ACS不稳定斑块密切相关:(1)CD4~+CD28~-T淋巴细胞能产生高IFN-γ,可通过IFN-γ的作用活化单核巨噬细胞。(2)CD4~+CD28~-T淋巴细胞共表达KIRs和NKRs获得不依赖TCR作用的溶细胞毒功能,杀伤内皮细胞,而且CRP可放大CD4~+CD28~-T淋巴细胞杀伤内皮细胞的效应。(3)CD4~+CD28~-T淋巴细胞通过表达TRAIL与病变中表达CCR5的血管平滑肌细胞结合,可不依赖TCR作用诱导SMCs凋亡。因此,CD4~+CD28~-T淋巴细胞有类似NK细胞的作用。此外,ACS患者外周血循环中的CD4~+CD28~-T淋巴细胞可向粥样斑块病变聚集,特别是在IL-12的诱导下,明显向AS斑块病变募集。由此可以认为,ACS全身炎症增强和AS斑块的不稳定与CD4~+T淋巴细胞的免疫衰老转变及CD4~+CD28~-T细胞亚群增殖有关。而抑制CD4~+T淋巴细胞衰老及CD4~+CD28~-T淋巴细胞亚群产生则可能缓解ACS的发生与发展。另一方面,研究显示冠心病和肺炎衣原体、幽门螺杆菌等多种微生物抗原相关,而这些微生物携带的HSP60与ACS关系密切。病理学研究证实冠脉晚期粥样硬化的斑块组织中高表达HSP60,HSP60存在于斑块内皮细胞、内膜和中膜平滑肌细胞、内膜泡沫细胞,甚至浸润到外膜的单核细胞以及外膜滋养血管。最近研究发现CD4~+CD28~-T淋巴细胞的增殖是针对体内和或AS斑块的微生物或自身抗原持续免疫反应的结果,而HSP60可以作为AS斑块来源的CD4~+T淋巴细胞的自身靶抗原。AS相关应激因子刺激内皮细胞过度表达HSP60,经APCs递呈诱导引起自身反应性CD4~+T淋巴细胞损伤;或者CD4~+T淋巴细胞浸润到斑块内,并通过自身免疫反应,损伤过度表达HSP60的细胞和组织。近期国内外研究还具体观测到HSP60抗原可以刺激CD4~+CD28~-T细胞产生大量的INF-γ及炎症细胞因子,HSP60可以被ACS患者体内CD4~+CD28~-T淋巴细胞识别等现象。此外研究还发现HSP60可以促进树突状细胞(DCs)的功能成熟,负载HSP60的DCs可促进AS斑块的进展。综合以上研究,CD4~+T淋巴细胞可能针对HSP60等自身抗原产生持续的免疫反应,引起CD4~+T淋巴细胞免疫衰老和重构,导致CD28抗原表达缺失并新生表达NKRs和KIRs等细胞表面分子,造成CD4~+T淋巴细胞的功能表现型出现偏倚,最终促使AS斑块的不稳定性转变,这可能是造成ACS事件的作用机制之一。然而,目前ACS,血清HSP60和外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞三者相互间的研究尚未见大量报导。临床ACS患者血清HSP60与外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞是否具有相关性,HSP60是否可以引起CD4~+T淋巴细胞亚群改变,HSP60是否通过促进DCs成熟进而诱导CD4~+T淋巴细胞亚克隆的偏倚?目前对此仍不清楚。此外他汀类药物可通过调节T淋巴细胞和抗原递呈细胞(APCs)的功能发挥免疫调节作用,临床应用阿托伐他汀治疗ACS后伴随有CRP的下降和Th1细胞因子的减少,外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量显著下降。他汀类药物在治疗ACS过程中是否在上述环节中造成影响亦不可知。针对以上问题,本研究拟首先观察ACS患者血清HSP60水平与外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量的相关性;然后利用体外细胞分选和培养技术,以流式细胞术观察CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量变化、以ELISA技术检测CD4~+T细胞分泌IFN-γ的变化,研究HSP60作用于CD4~+T淋巴细胞的可能途径,最后探讨他汀类药物影响HSP60对CD4~+T淋巴细胞表型的作用。具体实验共分为三个部分:①临床研究:入选临床确诊为正常对照(Normal)、稳定性心绞痛(SAP)和ACS患者三组人群,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CRP、HSP60、TNF-α、IFN-γ浓度,应用流式细胞术(FCM)检测CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量占CD4~+T淋巴细胞的百分比,结合主要的心血管危险因子分析它们之间的相关性。②体外试验:应用细胞分离技术获得PBMC,将其定向诱导分化为成熟的DCs;再通过免疫磁珠分选技术获得CD4~+T淋巴细胞,并与成熟的DCs体外共培养,通过FLM和ELISA检测,检测负载HSP60的DCs作用后,CD4~+T淋巴细胞表面CD28分子的表达和IFN-γ分泌变化。③药物干预试验:在负载HSP60的DCs和CD4~+T淋巴细胞共培养下应用阿托伐他?atorvastatin)和甲羟戊酸(MVA)干预,观察CD4~+T淋巴细胞表达CD28分子和分泌IFN-γ的变化。结果分述如下:1.ACS患者外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量和血清HSP60的相关性研究1.1 ACS组对比SAP组和正常组,血清CRP、HSP60、TNF-α、IFN-γ和外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比升高均有显著性意义(P均=0.000);SAP组对比正常组,血清CRP、HSP60、TNF-α和外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比差异均无显著性意义(P均＞0.05);而SAP组对比正常组血清IFN-γ升高亦有显著性意义(P=0.000)。说明上述指标升高和ACS发生发展相关。1.2以外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比在总样本中中位数的4.29%为界,在＞4.29%时,外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量与ACS有相关性(x~2=32.759,P=0.000);用ROC曲线分析外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比对ACS的诊断价值,结果曲线下面积为0.763,面积的标准误为0.031,外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量用于诊断ACS有显著性意义(P=0.000)。以血清HSP60在总样本中的中位数317.7ng/L为界,在HSP60＞317.7ng/L时与ACS的相关性存在显著性意义(x~2=34.550,P=0.000);用ROC曲线分析血清HSP60对ACS的诊断价值,结果曲线下面积为0.810,面积的标准误为0.028,血清HSP60用于诊断ACS有显著性意义(P=0.000)。说明血清HSP60以及外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量升高对ACS有诊断价值。1.3 Spearman相关分析发现在ACS组外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比主要与血清HSP60及年龄相关(r=0.763/r=0.660),与血清IFN-γ、HsCRP、TNF-α、性别、高血压史、吸烟史关系不密切。在控制了年龄、IFN-γ、HsCRP、TNF-α、性别、高血压史、吸烟史等因素后偏相关分析显示外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比与血清HSP60含量相关有显著性意义(r=0.527,P=0.000)。说明ACS患者血清HSP60和外周血CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量关系密切。2.HSP60诱导人CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖的研究2.1 HSP60对CD4~+T淋巴细胞亚组表型和细胞因子分泌的影响采用细胞共培养,实验分为4个处理组(每组n=6):每组分别加入不同浓度的HSP60抗原刺激①PBS阴性对照组;②1mg/L HSP60组;③10mg/L HSP60组;④100mg/L HSP60组。每组分别观察作用后26小时和72小时的变化。①检测细胞培养上清液IFN-γ含量:不同剂量HSP60组对比阴性对照组降低均有显著性意义(P均＜0.05);而不同HSP60剂量组间对比差异无显著性意义(P均＞0.05);四组CD4~+T淋巴细胞在26小时和72小时分泌的IFN-γ量对比差异均无显著性意义(P均＞0.05)。说明HSP60直接刺激人CD4~+T淋巴细胞,可抑制其分泌IFN-γ,而不同剂量HSP60无明显差异;②检测CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比:四组间对比差异无显著性意义(P均＞0.05);各组作用72小时和作用26小时对比,其升高均有显著性意义(P均＜0.05)。说明随着培养时间的延长CD4~+CD28~-T淋巴细胞百分比增加,但HSP60并不直接影响CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖。2.2 HSP60对人PBMC来源的DCs成熟的影响:试验分为3组:对照组(n=6)、低剂量HSP60处理组(n=6)、高剂量HSP60处理组(n=6)。①低剂量HSP60-DCs组、高剂量HSP60-DCs组其CD80和CD86表达的阳性率和对照组对比,增高均有显著性意义(P均=0.000);高剂量HSP60-DCs组和低剂量HSP60-DCs组其CD80和CD86表达的阳性率对比,增高有显著性意义(P=0.000)。说明HSP60能促进人PBMC来源的DCs表达共刺激分子CD80和CD86,且高剂量更为明显,提示其将抗原递呈给T淋巴细胞的功能增强。②低剂量HSP60-DCs组、高剂量HSP60-DCs组其刺激T淋巴细胞增殖的能力较对照组增强,其差异均有显著性意义(P均=0.000);且高剂量HSP60-DCs组其刺激T淋巴细胞增殖的能力高于低剂量HSP60-DCs组(P均=0.000)。说明HSP60-DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力增强,且高剂量更为明显。2.3负载HSP60的DCs与CD4~+T淋巴细胞混合培养对CD4~+CD28~-T淋巴细胞百分比和细胞因子IFN-γ分泌的影响:实验分为4组:PBS组(PBS+CD4~+T,n=6);DCs组(DCs+CD4~+T,n=6);低剂量HSP60-DCs(低剂量组HSP60-DCs+CD4~+T,n=6);高剂量HSP60-DCs(高剂量HSP60-DCs+CD4~+T组,n=6)。每组按细胞比DCs:CD4~+T细胞1:10和1:1两种方案进行混合细胞培养。①检测上清液IFN-γ:低剂量HSP60-DCs组和高剂量HSP60-DCs组对比DCs组和PBS组,增高均有显著性意义(P均＜0.05);高剂量HSP60-DCs组对比低剂量HSP60-DCs组差异无显著性意义(P=0.130);DCs组对比PBS组增高亦有显著性意义(P=0.022);但不同DCs:CD4~+T细胞比混合培养差异无显著性意义(P=0.063)。说明DCs可促进CD4~+T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ;负载HSP60的DCs作用更加明显;在共培养体系中,增加树突状细胞的数量,上清液IFN-γ变化无显著性意义。②检测CD4~+CD28~-T淋巴细胞百分比:低剂量HSP60-DCs组和高剂量HSP60-DCs组对比PBS组和DCs组,增高均有显著性意义(P均＜0.05);但高剂量HSP60-DCs组对比低剂量HSP60-DCs组差异无显著性意义(P＞0.05);DCs组对比PBS组差异亦无显著性意义;不同DCs:CD4~+T细胞比混合培养,差异无显著性意义(P＞0.05)。说明负载HSP60的DCs才能显著诱导CD4~+T淋巴细胞下调CD28分子表达,使CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比增加,但是增加负载HSP60的剂量作用无显著增加,增加DCs细胞的比例,CD28分子表达下调无显著性意义。3.阿托伐他汀干预负载HSP60的DC诱导CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖的研究实验分为3个处理组:①HSP60-DCs+CD4~+T组(对照组,n=6);②HSP60-DCs+CD4~+T+Ato(At0组,n=6);③HSP60-DCs+CD4~+T+Ato+MVA(MVA组,n=6);按细胞比DCs:CD4~+T细胞1:10进行混合细胞培养。3.1 Ato和MVA影响HSP60-DCs促CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ的作用检测混合细胞培养上清液IFN-γ含量,Ato组对比对照组下降有显著性意义(P＜0.05);MVA组对比Ato组增加有显著性意义(P＜0.05);MVA组与对照组间差异无显著性意义(P＞0.05)。说明阿托伐他汀抑制HSP60-DCs诱导CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ,而且这种作用可以被甲羟戊酸逆转。3.2 Ato和MVA影响HSP60-DCs促CD4~+T淋巴细胞共刺激分子CD28的表达检测混合细胞培养后CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量百分比,Ato组对比对照组下降有显著性意义(P＜0.05);MVA组对比Ato组增加有显著性意义(P＜0.05);MVA组与对照组间差异无显著性意义(P＞0.05)。说明阿托伐他汀抑制HSP60-DCs诱导的CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖;而且这种作用可以被甲羟戊酸逆转。通过上述三个部分的实验,我们能够得出以下结论:①临床研究证实ACS患者外周血中CD4~+CD28~-T淋巴细胞显著增多、Th1细胞因子显著增高,提示ACS患者可能存在CD4~+T淋巴细胞偏倚,其独特的细胞毒作用和组织破坏特性使其可能与AS斑块的失稳定密切相关;ACS患者血清HSP60含量显著增高,是与ACS密切相关的自身抗原之一,在ACS患者中HSP60与CD4~+CD28~-T淋巴细胞数量密切相关;②体外试验证实HSP60可通过下调DCs细胞表面共刺激分子CD80和CD86,影响DCs的成熟和功能,进而下调CD4~+T淋巴细胞表达CD28分子,使CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖和细胞因子IFN-γ分泌增加;③体外研究证实阿托伐他汀可上调CD4~+T淋巴细胞CD28分子的表达,其机制可能是通过MVA代谢途径,影响了负载HSP60的DCs递呈抗原及CD4~+T淋巴细胞的表现型,使CD4~+T淋巴细胞上调CD28分子表达并抑制IFN-γ分泌,提示阿托伐他汀具有抗炎和免疫调节作用,对抑制ACS发生发展的应用方面具有广阔前景。