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研究背景
子痫前期（preeclampsia,PE）是人类妊娠期常见的一种多系统疾病，发生率约2％～8％，严重威胁着母婴健康，是导致孕产妇和胎儿围产期死亡的主要产科并发症。临床特征为妊娠20周以后出现高血压（BP≥140/90mmHg）及蛋白尿（尿蛋白≥0.3g/24h或随机尿蛋白阳性）。几十年来，妇产界许多研究者长期致力于该病的研究，但至今子痫前期的病因和发病机制尚未阐明。除终止妊娠之外缺乏有效的临床治疗方法，始终是引起孕产妇死亡的主要原因之一。因此，该病一直是产科领域研究的热点。临床发现子痫前期在胎盘娩出后临床症状逐渐消失，因此胎盘成为子痫前期发病的关键，胎盘学研究成为子痫前期病因学研究焦点。滋养细胞(cytotrophoblast，CT)是胎盘组织中主要的细胞类型，与母体接触最为紧密，它的分化、迁移、侵入异常直接导致胎盘形成缺陷，与子痫前期的发病密切相关。子痫前期胎盘病理特点之一为合体滋养细胞(syncytiotrophoblast，ST)层发育不良。Sha等首次于2000年报道，人内源性逆转录缺陷病毒(humanendogeneousretrovirus，HERV)家族一员HERV-W的包膜蛋白syncytin在胎盘组织高度表达。Syncytin的功能有介导体内胎盘滋养细胞的生长分化，促进细胞融合，抗凋亡和免疫抑制等。Syncytin-1是一个功能性融合蛋白可以介导滋养细胞融合成合体滋养细胞，这种多核的合体滋养细胞层是营养交换的场所，还可以分泌人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin，HCG)和人绒毛膜促乳素(humanchorionicsomatomammotropin，HCS)，对于维持正常的胎盘功能非常重要。Syncytin表达减少会导致细胞滋养细胞融合与分化异常，合体滋养细胞形成减少，血管功能紊乱和绒毛缺氧，可能是子痫前期的病因之一。
除了传统的研究，人们逐渐认识并越来越重视表观遗传学在PE发病中的作用。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，在DNA甲基转移酶DNAmethyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化为5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的一种化学反应。DNA甲基化的作用包括调控基因表达、基因印记、维持基因组和染色体结构的稳定性等。Syncytin甲基化在子痫前期胎盘的状态国内外报道较少，DNMT3L与syncytin甲基化的关系国内外未见报道。本研究采用实时定量PCR，免疫组化，Westernblot方法检测子痫前期胎盘组织syncytin-1mRNA及蛋白表达，甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)，结合亚硫酸氢盐限制分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)，测序技术检测syncytin-1启动子区甲基化状态。探讨syncytin-1在子痫前期中的发病机制以及其甲基化与基因表达的关系，为PE的诊断病情监测治疗提供依据。
第一部分子痫前期胎盘syncytin-1甲基化状态
目的:
分析子痫前期胎盘组织中syncytin-1的表达情况，syncytin-1甲基化状态及其与基因表达的关系，探讨子痫前期的发病机制。
方法:
1.实时定量PCR法检测syncytin-1，ASCT2，HCS，GCMa，DNA甲基转移酶1(DNMT1)，DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)，DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)，DNA甲基转移酶3L(DNMT3L)在正常第三期(3N)和子痫前期(3P)胎盘组织mRNA水平;
2.免疫组化法检测syncytin-1，HCS，DNMT1，DNMT3b，DNMT3L,5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytidine，5mC）在子痫前期和正常胎盘组织蛋白定位表达情况;Westernblot法检测syncytin-1在子痫前期和正常胎盘组织蛋白表达情况;
3.采用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR，MSP)，结合亚硫酸氢盐限制分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)和重亚硫酸氢盐测序方法，检测子痫前期胎盘和正常胎盘组织syncytin-1启动子区5-LTRs甲基化状态。
结果:
1.以GAPDH为内参照基因，与正常第三孕期(3N)相比，子痫前期(3P)胎盘组织中DNMT3a，DNMT3b，syncytin-1和HCSmRNA表达水平降低(P＜0.05)，DNMT1，DNMT3LmRNA表达水平升高(P＜0.05);GCMa，ASCT2两组比较无显著性差异(P＞0.05);PCNA为内参照基因，与3N相比，3P胎盘组织中DNMT1，DNMT3b，DNMT3LmRNA表达水平升高，DNMT3amRNA表达水平降低(P＜0.05)。
2.与3N相比，3P胎盘组织中syncytin-1和HCS蛋白表达较弱，DNMT3b，DNMT3L蛋白表达较强，而DNMT1，5mC染色结果两组无显著差异;Westernblot分析显示，syncytin-1在3N胎盘组织中强表达，在3P胎盘中弱表达;
3.MSP，COBRA和测序结果均显示，与3N相比，3P胎盘组织中syncytin-1启动子区5-LTRs甲基化水平升高(P＜0.05);
4.Spearman相关性分析，syncytin-1与DNMT3bmRNA水平负相关(r=-0.544，P＜0.05);Syncytin-1与HCSmRNA水平正相关(r=0.713，P＜0.01);Syncytin-1mRNA水平与其甲基化水平呈负相关（r=-0.505，P＜0.05）;DNMT3b与syncytin-1甲基化水平呈正相关(r=0.451，P＜0.05);DNMT3L与syncytin-1甲基化水平呈正相关(r=0.536，P＜0.05);DNMT3b与DNMT3LmRNA水平正相关（r=0.554，P＜0.05）;三种常用的甲基化检测方法中，MSP和COBRA(r=0.443，P＜0.05)，COBRA和测序（r=0.862，P＜0.01）结果呈正相关。
结论:
1Syncytin-1表达降低与子痫前期发病密切相关，但其受体ASCT2与子痫前期发病无关;
2.在子痫前期syncytin-1异常升高的甲基化模式参与了子痫前期的发病，机制可能是syncytin-1启动子区高甲基化抑制了其基因的表达;
3.DNMTs参与了syncytin-1甲基化的调节，以PCNA为内参照基因排除细胞增殖因素后，DNMT3L和DNMT3b在子痫前期高表达并都与syncytin-1甲基化水平呈显著正相关，DNMT3L与DNMT3b协同作用促进syncytin-1启动子区CpG的甲基化，从而抑制了syncytin-1基因的表达。