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目的肥胖是引起Ⅱ型糖尿病、心血管疾病及其他疾病包括癌症的重要因素,肥胖所引发的全身性、低水平的慢性炎症,可以引起胰岛素抵抗、高血压、高血脂等一系列代谢综合征,目前被认为是肥胖相关疾病的“共同土壤”,肥胖及其引发的疾病已成为二十一世纪威胁人类健康的重要因素之一。肥胖诱发胰岛素抵抗及代谢紊乱的相关机制目前并不十分明确,但越来越多的证据显示脂肪组织炎症在其中发挥了桥梁作用。脂肪组织炎症主要指发生于白色脂肪组织的炎症,表现为炎性细胞如巨噬细胞及T细胞的浸润和活化以及促炎因子TNF-α、IL-6等的表达升高,可以诱发肝脏、脂肪等组织的胰岛素抵抗,进而导致代谢紊乱和肥胖相关疾病的发生。因此,肥胖及其相关炎症的控制是预防和治疗肥胖相关疾病的重要措施。程序性细胞死亡因子4(Programmed cell death4, PDCD4),是一种最初发现于细胞凋亡的基因,它普遍表达于正常组织,在肝中表达最高。PDCD4主要通过影响转录和翻译发挥调节作用,近年发现PDCD4参与一些炎症性疾病的发生发展,研究表明PDCD4缺失不仅抵抗实验性脑脊髓膜炎和Ⅰ型糖尿病的发生,还可以负向调控脂多糖诱导的致死性炎症,提示PDCD4具有促炎作用。然而PDCD4是否参与肥胖及相关炎症的发生,目前尚无研究涉及。肝X受体(Liver X receptor, LXR)-α,是核受体家族的成员,它广泛分布于多种组织中,并且发挥转录调控作用。LXR-α可以通过上调三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter, ABC)A1和G1的表达促进胆固醇由外周组织向肝脏的逆向转运,也可直接或间接调控其他脂质代谢相关基因的表达发挥平衡脂质的作用。为了明确PDCD4对饮食诱导肥胖的影响及其机制,本课题分别对PDCD4敲基因(PDCD4-/-)小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠进行高脂饮食喂养,并对其肥胖程度、脂肪组织炎症、肝脏脂肪变等情况进行研究,并进一步通过相关细胞实验对相关机制进行了探讨,证明了PDCD4参与介导饮食诱导的肥胖、脂肪组织炎症及脂肪肝的发生,并明确了PDCD4通过结合并影响LXR-α mRNA的翻译而发挥作用。方法1.PDCD4对饮食诱导肥胖的影响1.1饮食诱导肥胖小鼠模型的建立雄性PDCD4-/-和WT C57BL/6小鼠在8周龄时给予高脂饲料喂养24周,以建立饮食诱导肥胖模型。每组3-5只,同时设立常规饲料喂养对照组小鼠。1.2PDCD4基因缺失对高脂小鼠肥胖的影响每隔1周对高脂及常规喂养小鼠进行称重,同时监测饮食量的变化。高脂饮食喂养至24周时,处死小鼠取其附睾周围白色脂肪组织进行称重。对白色脂肪组织切片进行HE染色,观察细胞形态,比较细胞大小。1.3PDCD4基因缺失对高脂小鼠白色脂肪组织炎症的影响取高脂及常规喂养24周的小鼠白色脂肪组织切片进行CD68染色,观察巨噬细胞浸润情况。RT-PCR法检测并比较炎性因子TNF-α和IL-6的表达。1.4PDCD4基因缺失对高脂小鼠肝脏脂肪变的影响取高脂及常规喂养24周的小鼠肝脏进行称重；并对肝脏切片进行HE染色,观察肝细胞脂肪变情况；抽提并比较肝脏中的甘油三酯含量。2.PDCD4影响饮食诱导肥胖的机制研究2.1能量消耗的检测高脂饮食喂养至20周时,将小鼠放入代谢笼48h,根据系统监测得到的数据作出统计图比较能量消耗情况。2.2LXR-α表达的检测2.2.1棕色脂肪组织中LXR-α的表达取高脂及常规喂养24周的小鼠棕色脂肪组织,Real-time PCR和Western-blot法检测LXR-α以及相关基因PGC-1α和UCP1的表达。2.2.2白色脂肪组织中LXR-α的表达取高脂及常规喂养24周的小鼠白色脂肪组织,Real-time PCR和Western-blot法检测LXR-α及其下游靶基因SREBP-1c、FAS、SCD1、ABCA1和ABCG1的表达。2.2.3肝脏中LXR-α的表达取高脂和常规喂养24周的小鼠肝脏,Real-time PCR和Western-blot法检测LXR-α的表达。2.2.4ox-LDL刺激骨髓来源的巨噬细胞检测LXR-a的表达取常规喂养的PDCD4-/-和WT小鼠的巨噬细胞,ox-LDL(50μg/ml)刺激不同时间段,收集细胞用Western-blot法检测LXR-α的表达,油红O染色明确巨噬细胞中油脂的变化。2.3干扰实验明确LXR-α的功能2.3.1LXR-α siRNA干扰PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞取常规饲料喂养的PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,利用GenePORTER2转染试剂转染LXR-α siRNA,同时转染无关对照siRNA。对干扰48h的细胞用ox-LDL (50μg/ml)刺激24h,油红O染色明确巨噬细胞中油脂的变化。2.4RIP实验明确PDCD4是否结合LXR-α的]mRNA取常规饲料喂养的WT小鼠巨噬细胞,ox-LDL (50μg/ml)刺激24h,收集巨噬细胞进行RIP实验。结果1.PDCD4基因缺失抑制饮食诱导的肥胖1.1PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠体重的增加体重及饮食量监测表明,高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠体重明显轻于高脂饮食喂养24周的WT小鼠,而常规饮食组差异不大。四组小鼠饮食摄取量无明显差异。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠体重的增加。1.2PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠白色脂肪组织的增多高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪组织重量明显轻于高脂饮食喂养24周的WT小鼠,而常规饮食组差异不大。小鼠脂肪组织切片的HE染色发现高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪组织细胞大小明显小于高脂饮食喂养24周的WT小鼠,而常规饮食喂养组差异不大。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠白色脂肪组织的增多。1.3PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠的白色脂肪组织炎症高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪组织石蜡切片中CD68表达少于高脂饮食喂养24周的WT小鼠,而常规饮食组差异不大。高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪组织中炎性因子TNF-α和IL-6的表达低于高脂饮食喂养24周的WT小鼠。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠的白色脂肪组织炎症。1.4PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠脂肪肝的形成高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠肝脏重量明显轻于高脂饮食喂养24周的WT小鼠,而常规饮食喂养组差异不大。小鼠肝脏切片的HE染色发现高脂饮食喂养的WT小鼠肝细胞呈现空泡化,高脂饮食喂养的PDCD4-/-小鼠脂肪肝现象减轻,而常规饮食喂养组差异不大。同时,高脂饮食喂养的PDCD4-/-小鼠中甘油三酯含量亦明显低于高脂饮食喂养的WT小鼠。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠脂肪肝的形成。2.PDCD4介导饮食诱导肥胖的机制研究2.1PDCD4基因缺失增加能量的消耗高脂饮食喂养20周的PDCD4-/-小鼠比高脂饮食喂养20周的WT小鼠能量消耗明显增多,而常规饮食喂养组差异不大。提示PDCD4基因缺失增加高脂小鼠的能量消耗。2.2PDCD4基因缺失促进LXR-α的表达2.2.1PDCD4基因缺失促进高脂小鼠棕色脂肪组织中LXR-α的表达高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠棕色脂肪组织中LXR-α的表达高于WT小鼠,同时PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平均高于WT高脂小鼠。但两组小鼠UCP1的表达没有明显差异。提示PDCD4基因缺失促进高脂小鼠棕色脂肪组织中LXR-α以及能量消耗相关基因PGC-1α的表达。2.2.2PDCD4基因缺失促进高脂小鼠白色脂肪组织中LXR-α及其下游靶基因的表达高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪组织中LXR-α及其下游靶基因SREBP-1c、FAS、SCD1、ABCA1和ABCG1的表达高于WT小鼠,而常规饮食喂养组差异不大。提示PDCD4基因缺失促进高脂小鼠白色脂肪组织中LXR-α及其下游靶基因的表达。2.2.3PDCD4基因缺失促进高脂小鼠肝脏中LXR-α的表达高脂饮食喂养24周的PDCD4-/-小鼠肝脏中LXR-α表达高于WT小鼠,而常规饮食喂养组差异不大。提示PDCD4基因缺失促进高脂小鼠肝脏中LXR-α的表达。2.2.4PDCD4基因缺失促进骨髓来源巨噬细胞中LXR-α的表达ox-LDL分别刺激来自常规饮食PDCD4-/-和WT小鼠的巨噬细胞12h和24h,同时设置未刺激对照组。结果发现PDCD4-/-小鼠中LXR-α的表达随着刺激时间的增长呈上升趋势,而WT小鼠中其变化不明显。提示PDCD4基因缺失促进ox-LDL刺激的巨噬细胞中LXR-α的表达。2.3LXR-α抑制油脂的累积ox-LDL刺激常规饮食PDCD4-/-和WT小鼠的巨噬细胞24h,PDCD4-/-小鼠巨噬细胞中油脂的含量明显低于WT小鼠。LXR-α siRNA可有效干扰来自常规饮食PDCD4-/-小鼠腹腔巨噬细胞中LXR-α的表达。ox-LDL刺激巨噬细胞24h,转染LXR-α siRNA组油脂含量显著高于转染无关对照siRNA组。提示LXR-α参与抑制PDCD4-/-小鼠腹腔巨噬细胞中的油脂累积。2.4PDCD4通过结合LXR-α的mRNA抑制其表达ox-LDL刺激来自常规饮食WT小鼠的巨噬细胞24h,收集细胞后进行RIP实验,Real-time PCR结果发现PDCD4抗体组中LXR-α的mRNA表达水平显著高于对照抗体组,提示PDCD4可以结合LXR-α的mRNA。结论1.PDCD4基因缺失抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖。2.PDCD4基因缺失缓解高脂小鼠的白色脂肪组织炎症。3.PDCD4基因缺失缓解高脂小鼠的脂肪肝病变。4.PDCD4通过结合LXR-α的mRNA抑制其翻译从而发挥相关作用。局限性尚未明确PDCD4介导饮食诱导肥胖的其它靶基因。