愈伤组织是柑橘等果树种质创新和离体保存的重要外植体,体细胞胚发生是愈伤组织离体培养再生的最主要途径。因此,愈伤组织体细胞胚发生能力的有效维持是利用生物技术改良品种和种质离体保存成功与否的关键。但不同品种的愈伤组织,其胚性能力的维持与体细胞胚发生能力差异很大。本研究以体细胞胚发生能力极强的伏令夏橙为试材,以其胚性(EC)、非胚性愈伤组织(NEC)以及由胚性愈伤组织诱导产生的不同发育阶段的愈伤及胚状体材料,构建抑制性差减文库(SSH),经Microarray杂交筛选,分离与胚性能力维持和体细胞胚发生早期相关的特异基因,在转录水平上探明体细胞胚发生的分子机制。主要研究结果如下：1.利用细胞学手段研究NEC、EC以及愈伤组织体细胞胚发生过程的特征性变化。结果表明：EC不仅在胚胎发生能力上与NEC存在差异,而且在其细胞形态特征上与NEC也存在着明显的区别,如细胞形状、细胞大小、颜色和质地。在亚细胞水平上,EC的细胞内具有典型的细胞核结构,核膜结构清晰,细胞质浓,液泡小且呈分散排布,而NEC细胞中未观察到典型的细胞核结构,细胞膜界限模糊不清,具有很大的成熟液泡。胚性愈伤诱导2周后,细胞中细胞核核仁体积变大,胞质变浓；诱导4周后细胞成熟,出现大液泡。此外,EC中具有丰富的蛋白体结构,同时体细胞胚诱导过程中淀粉体的动态变化,使得EC具有了胚性分化的动力,有利于胚性细胞向胚状体发育并向植株的方向转变;胞间连丝的存在使得这些胚性细胞保持了生理上的有机联系,有利于这些细胞间的物质交换；生理隔离是细胞表达胚性潜力的前提条件。2.分离鉴定与柑橘体细胞胚性能力维持和体细胞胚诱导和发育相关的关键基因并揭示其相关代谢过程。通过对已构建的3个SSH文库的Microarray筛选,共获得988 unisequences。LEC1/B3 domain调控网络的若干基因(LEC1、L1L、FUS3、ABI3和ABI5)第一次在柑橘体细胞胚发生过程中被鉴定,这些基因表达的动态变化表明其可能是体细胞胚发生起始的必要条件,且可能是调节柑橘体细胞胚发生进程所必需。此外,分离获得了一些感兴趣的基因,如编码homeobox-leucine zipper protein (HB)、B3 domain containing protein、bZIP protein、MYB protein、IAA9和tubby like protein (TLP)等基因。根据Microarray筛选的差异表达结果,利用qRT-PCR方法进一步检测了8个基因(LEC1、FUS3、L1L、ABI3、ABI5、B3 domain containing gene、HB4和TLP)在柑橘不同胚性能力愈伤组织中的表达情况。结果表明：除L1L在低胚性能力的冰糖橙和奥林达夏橙愈伤品种中也能检测到较高水平的表达外,在具有较强体细胞胚发生能力的愈伤中其他基因的表达量均高于低胚性能力愈伤(特别是国庆1号愈伤),这类基因上调表达暗示其可能在决定柑橘不同品种胚性能力的高低中起作用。这为更好地了解不同柑橘品种体细胞胚发生能力差异的原因提供了分子上的证据。3.差减文库经Microarray筛选获得了LEC1和HB4两个基因片段,采用RACE技术克隆其全长,序列分析表明：CsLEC1基因cDNA全长为976 bp,编码251个氨基酸；CsHB4基因cDNA全长为1291 bp,预测含有一个864 bp的开放阅读框,编码287个氨基酸。表达分析显示,体细胞胚发生过程中CsLEC1的表达量呈先上升后下降的趋势,而在非胚性愈伤及其它组织器官中均未检测到其表达,推测CsLECl基因仅在体细胞胚发生起始阶段起作用,而不参与其他组织器官的生长发育。柑橘体细胞胚发生过程中CsHB4的表达量变化趋势复杂,表现为先降低后升高,同时在其他组织器官,如子房、叶片、茎、花柱、幼花中也检测到低的表达量,这在某种程度上说明CsHB4基因在参与体细胞胚发生过程中发挥了重要的作用,同时可能在其它发育阶段也行使功能。4.利用同源序列法从伏令夏橙的胚性愈伤中克隆了一个SERK (somatic embryogenesis receptor-like kinase)基因,命名为CitSERK1-like, CitSERK1-like具有典型的SERK结构域,亮氨酸拉链、富辅氨酸结构域和C-末端,与温州蜜柑上克隆的CitSERKl氨基酸序列比较发现,在亮氨酸拉链区存在15个氨基酸的差异。qRT-PCR和原位杂交结果表明,CitSERK1-like基因在具有体细胞胚发生能力的EC和具有增殖能力的NEC中均有表达,只是CitSERK1-like基因的表达分布不同。因此,柑橘中不能把CitSERK1-like基因作为胚性细胞的标记基因。但胚性愈伤和诱导阶段的胚性愈伤中CitSERK1-like基因的表达量增高,说明CitSERK1-like基因的上调表达与体细胞胚发生存在着某种必然的联系。同时,CitSERK1-like基因表达不仅仅限于体细胞胚发生阶段,在具有增殖潜力的组织器官中也能检测到,如花器官、幼叶；但在低增殖能力的成年树的成熟叶中其表达量很低。对CitSERK1-like基因的精确定位分析对研究其在体细胞胚发生和植物生长发育过程中的作用具有十分重要的意义。