第一部分黏蛋白MUC5AC作为宫颈腺癌新型诊断分子标志物的研究[研究背景]宫颈癌是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一,近年来,由于女性宫颈癌筛查和HPV疫苗的推广,鳞状细胞癌的发病率有所下降,而宫颈腺癌由于在癌变前期难以发现,且现有的筛查方法如细胞学筛查敏感性较差,因此发病率相对有所上升,且逐渐呈年轻化趋势。虽然宫颈腺癌及腺鳞癌的治疗类似于宫颈鳞癌,但因其病因学、组织学类型及生物学行为均与鳞癌不同,腺癌表现出更具侵袭性、术后易复发、易转移的生物学特性,对放化疗的敏感性相对较低,预后较同期鳞癌差。因此针对不同病理学类型开展不同的治疗方案正逐渐提上日程,但其基础是对宫颈癌做出明确的病理诊断,对宫颈癌准确分型。目前CK7、P63、P40、CK5/6常常联合用于宫颈低分化鳞状细胞癌与腺癌的鉴别诊断,但是CK7特异性较差,因此寻找新的腺癌标志物称为本研究的目标。本研究应用免疫组织化学方法对101例宫颈鳞癌组织和108例腺癌组织中MUC5AC、CK7、CK5/6、P40、P63蛋白的表达情况进行检测,以探讨MUC5AC是否可以作为宫颈腺癌新型诊断分子标志物,用于鉴别宫颈腺癌与鳞状细胞癌;并探讨其在不同类型宫颈腺癌中的表达情况。[研究方法]1.选择研究病例收集山东大学齐鲁医院2005年1月至2018年2月这13年来诊断及分型明确为宫颈低分化鳞癌和腺癌的病例,完善相关临床资料,选取病例的切片都经过两位病理医师再次阅片和判读。2.免疫组织化学染色及相关性分析对选取的临床宫颈鳞癌和腺癌标本进行MUC5AC、CK7、CK5/6、P40、P63的免疫组织化学染色,分析MUC5AC在不同病理类型病例中的表达情况及不同腺癌亚型中的表达情况。[结论]1.MUC5AC、CK7、CK5/6、P40、P63在宫颈腺癌和鳞癌组织中的表达情况均有显著性差异。2.MUC5AC较CK7诊断宫颈腺癌特异性好,在不同宫颈腺癌亚型中的表达无显著差异。3.CK7的表达对宫颈腺癌分化程度无显著影响,而随着宫颈腺癌分化程度越低,MUC5AC的失表达率越高。4.MUC5AC联合P40、P63可用于临床病理工作中宫颈腺癌和鳞癌的诊断及鉴别诊断。第二部分β-arrestin2对宫颈腺癌多药耐药基因1(MDR1)的调控作用及相关机制的研究[研究背景]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,近年来宫颈腺癌的发病率明显上升。目前,对于宫颈腺癌的治疗,化疗是非常有效的治疗手段,然而,在临床化疗过程中,逐渐出现的多药耐药严重影响了其治疗效果,是肿瘤治疗过程中面临的主要问题。多药耐药(MDR),是指肿瘤细胞在化疗过程中一旦对一种化疗药物产生了耐药性,也会对其他作用结构或靶点相同或不同的药物产生相同的作用。多药耐药的机制非常复杂,人类多药耐药基因1(MDR1)编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达是其主要的机制之一。P-糖蛋白是ABC家族的蛋白之一,是镶嵌在细胞膜上的ATP结合蛋白,通过将化疗药物从肿瘤细胞外排表现出对药物的抵抗性。我们发现在宫颈腺癌的临床标本中,β-arrestin2与MDR1的表达密切相关。因此,本研究主要探讨β-arrestin2对宫颈腺癌多药耐药基因1(MDR1)的调控作用及相关机制,寻找调控P-糖蛋白表达的治疗靶点,为逆转肿瘤的多药耐药带来新的希望。[研究方法]1.过表达载体pCDNA3.1-β-arrestin2-GFP全长表达载体由美国东田纳西大学尹德领教授惠赠。2.细胞培养及转染将上述质粒载体分别转染到2种宫颈腺癌细胞系HeLa、C33A中,继续培养48-72h 后,分别用 RT-qPCR 和 Western blot 检测各组细胞中β-arrestin2 与 MDR1/P-gp在mRNA和蛋白水平上的表达情况。3.检测过表达β-arrestin2质粒后宫颈腺癌细胞功能的变化①MTT:应用MTT法检测各组细胞对阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂的半数细胞致死量的改变;②细胞增殖能力分析:应用CCK8检测过表达β-arrestin2基因后对肿瘤细胞增殖能力的影响;③运用Western blot和RT-qPCR检测β-arrestin2基因的过表达与耐药蛋白及下游相关信号通路的表达。[结论]1.在宫颈腺癌中β-arrestin2的表达与分化程度有关,肿瘤分化程度越高,β-arrestin2的阳性率越高。2.在宫颈腺癌细胞中上调β-arrestin2的表达后,MDR1基因mRNA水平升高,差异具有统计学意义,但是P-gp蛋白表达明显升高,较mRNA水平升高显著。这表明,β-arrestin 2可能同时通过转录水平和转录后水平调控P-gp表达的上调。3.过表达β-arrestin2基因后,宫颈腺癌细胞增殖速率减慢,同时表现出对阿霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物的耐受性提高。4.过表达β-arrestin2后的宫颈腺癌细胞,NF-κB蛋白及mTOR通路相关蛋白表达升高,而PRMT7表达下降,提示β-arrestin2可能通过NF-κB通路及mTOR两条通路调控P-gp的表达,即一方面β-arrestin 2通过激活NF-κB,促进MDR1基因转录,另一方面可通过上调mTOR通路抑制PRMT7表达,进而诱导MDR1基因去甲基化,导致P-gp表达升高从而介导宫颈腺癌多药耐药的发生。