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目的:本文旨在研究中药附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)中的生物碱成分去甲乌药碱是否可以增强中药瓜蒌(Trichosanthes kirilowii Maxim.)来源的葫芦素B抑制乳腺癌增殖的作用,并通过网络药理学和Western blot技术预测并验证其作用机制。方法:1.采用CCK8试剂盒,检测药物在不同比例,不同作用时间的条件下,葫芦素B和去甲乌药碱单用与合用对乳腺癌细胞株SKBR3、T47D细胞增殖的影响。2.利用DAPI染色及Annexin V–FITC双染方法,检测葫芦素B和去甲乌药碱单用与合用对乳腺癌细胞SKBR3、T47D细胞凋亡的影响。3.利用流式细胞仪,检测葫芦素B和去甲乌药碱单用与合用对细胞周期的影响。4.建立SKBR3裸鼠移植瘤模型,研究葫芦素B和去甲乌药碱单用及合用在体内对乳腺癌的影响。5.采用网络药理学方法,对葫芦素B和去甲乌药碱单用及合用抑制乳腺癌增殖的靶点进行预测。6.采用Western blot技术,检测葫芦素B和去甲乌药碱单用与合用后,SKBR3及T47D细胞中AKT,p-AKT,CDK2,p-CDK2,cyclin A2,Bax,Bcl-2,p-Histone H3蛋白表达水平的变化。结果:1.葫芦素B可以抑制乳腺癌细胞SKBR3及T47D增殖,呈剂量依赖性和时间依赖性。去甲乌药碱可以增强葫芦素B对乳腺癌细胞的抑制作用。在所设定的比例中,当葫芦素B与去甲乌药碱按照10:1比例配伍时,抑制作用最强。2.去甲乌药碱可以增强葫芦素B诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。DAPI结果显示,二者合用之后,出现染色质凝集,凋亡小体增多现象。与通过流式细胞仪检测Annexin V/PI双染细胞的结果一致,在SKBR3和T47D细胞系中,葫芦素B和去甲乌药碱合用与两者单独使用相比,细胞凋亡百分率更高。3.经葫芦素B处理后,乳腺癌细胞的细胞周期会阻滞在G2/M期,葫芦素B与去甲乌药碱合用可以增加细胞在G2/M期的百分率。4.SKBR3移植瘤模型结果显示:和葫芦素B或去甲乌药碱单用相比,葫芦素B与去甲乌药碱合用可以显著抑制肿瘤生长。5.网络药理学分析结果显示:葫芦素B在乳腺癌中的预测靶点主要为AKT1,去甲乌药碱的靶点为cyclin A2和CDK2。AKT1的下游为CDK2和cyclin A2,葫芦素B抑制AKT1磷酸化,也同时抑制CDK2的磷酸化,而去甲乌药碱作用在CDK2及cyclin A2上从而增强葫芦素B的抑制作用。6.Western blot结果分析显示:葫芦素B与去甲乌药碱合用组和葫芦素B单用组相比较AKT和CDK2的磷酸化水平下降,cyclin A2和Bcl-2表达水平下降,Bax和Histone H3磷酸化水平增加。而总AKT,CDK2蛋白水平不变。结论:1.葫芦素B可以抑制乳腺癌细胞的生长,去甲乌药碱可以增强这一作用。主要通过对SKBR3,T47D细胞抑制增殖,阻滞周期以及诱导凋亡作用来实现。2.葫芦素B和去甲乌药碱合用对SKBR3裸鼠移植瘤模型也有协同抑制作用。3.网络药理学结果显示,葫芦素B和去甲乌药碱可能通过抑制AKT与CDK2相互作用来协同抑制乳腺癌细胞增殖。