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在日常生活中,大家都经历过痒,或是一过性(急性痒),或是慢性迁延(慢性痒);或是有皮肤局部(皮损)表现,或是痒无定位。和痛相似,急性痒是一种机体的保护机制,可使人避开伤害和危险,或早期帮助发现疾病;而慢性痒则失去了保护作用,还经常会导致睡眠障碍、心境恶劣、快感缺失、兴趣丧失等,久而久之,便会形成焦虑、抑郁等负性情绪,甚至导致自杀。另一方面,长期精神压力大或患有焦虑、抑郁等精神疾病,也常常会诱发或加重各种瘙痒性皮肤病,比如神经性皮炎、特异性皮炎、白癜风、银屑病等。即慢性痒可促进或诱发抑郁等负性情绪的发生,反之抑郁焦虑等负性情绪也可诱发或加重瘙痒,形成“瘙痒-抑郁-瘙痒”的恶性循环。目前,对于慢性痒(瘙痒性皮肤病)以及其所关联负性情绪的治疗仍缺乏行之有效的手段[1]。根本原因,在于瘙痒症与抑郁等精神性疾病交互恶化的机制尚未阐明,而解决这一问题的关键就是要找到既参与痒觉调控又参与负性情绪调控的靶分子。众所周知,下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA轴)的主要功能之一就是参与机体的应激反应。机体在受到外界的应激刺激后,下丘脑室旁核会分泌促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)参与应激反应。以往的研究提示:慢性痛与抑郁之间存在交互恶化的现象,CRH及其受体可能既参与痛的调节[2],也参与负性情绪的形成[3,4]。那么,在小鼠上如何建立适宜的模型,并通过行为学检测验证瘙痒与抑郁交互恶化的现象?CRH及其受体是否参与痒觉信息的调控?急性应激状态下痛觉与痒觉的感受减弱是否与血液中CRH浓度急剧增高有关?为解决这些问题,我们开展了本课题的研究。本研究首先在小鼠上建立了慢性痒模型、慢性应激所致抑郁模型,以及慢性痒与抑郁交互恶化模型,并通过系统的行为学检测观察了痒与抑郁交互恶化的行为学表现;其次,我们利用行为药理学、ELISA、免疫荧光组织化学染色、Western-blot、原位杂交等技术方法,系统研究了CRH在痒觉信息调控方面发挥的作用及相关的受体机制。故本论文分为以下两个部分进行探讨:第一部分慢性痒与抑郁交互恶化的行为学研究目的:建立慢性痒与抑郁交互恶化的动物模型,并观察痒与抑郁交互恶化的行为学表现。方法:(1)制备慢性痒模型。成年雄性C57小鼠,用0.15%的2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)丙酮混合溶液按相应方法涂抹皮肤5周后成模,对照组小鼠只用相同浓度的丙酮按程序涂抹。观察各组小鼠30 min内的搔抓次数,行强迫游泳、悬尾实验、溅水实验等抑郁行为检测,并通过转棒实验检测小鼠的运动能力。(2)制备抑郁模型。成年雄性C57小鼠,给予慢性不可预知性温和刺激(chronic unpredicted mild stimulation,CUMS),每天1次,对照组小鼠不给任何应激刺激,28 d后行抑郁行为及自发搔抓行为检测。(3)抑郁+慢性痒模型。成年雄性C57小鼠随机分为3组:A组(CUMS+DNFB组)给予CUMS的同时,行DNFB慢性痒模型(DNFB模型)制备;B组(CUMS组)只给CUMS;C组(DNFB组)只进行DNFB模型制备。各组处理时间均为14 d,之后检测3组小鼠的抑郁行为和搔抓行为,并对比分析。(4)抑郁对致痒剂所致急性痒的影响及抗抑郁药氯胺酮的干预效果。(1)CUMS模型小鼠与正常对照小鼠,分别给予颈部皮内注射组胺或氯喹,观察慢性应激所致抑郁对组胺或氯喹引起的急性痒的影响;(2)将小鼠分为A,B,C三组:A组(CUMS+K组)接受CUMS造模和氯胺酮腹腔注射;B组(CUMS+Sal组)接受CUMS造模和生理盐水腹腔注射;C组(K组)单纯接受氯胺酮腹腔注射。所有小鼠根据CUMS造模需求饲养28 d,在第0、14 d腹腔注射氯胺酮或生理盐水,28 d后检测各组小鼠的抑郁行为和搔抓行为。结果:(1)与丙酮对照组比较,DNFB慢性痒模型小鼠的自发搔抓次数,强迫游泳和悬尾实验中的不动时间,以及溅水实验中的理毛次数均明显增加(P<0.01)。(2)CMUS模型小鼠的自发搔抓次数,强迫游泳和悬尾实验中的不动时间,以及溅水实验中的理毛次数,均较对照组小鼠显著增加(P<0.01或P<0.05)。(3)CUMS+DNFB组小鼠在造模14 d后:(1)比CUMS组和DNFB组小鼠表现出更为明显的抑郁样行为(P<0.05或P<0.01);(2)30 min内的搔抓次数比其它两组均明显增多,且DNFB组小鼠的搔抓次数远比CUMS组的多(P<0.01)。(4)CMUS模型小鼠颈部皮内分别注射组胺或氯喹后,30 min内的搔抓次数均较对照组明显增加(P<0.05)。CUMS+K组小鼠与正常对照组和CUMS+Sal组小鼠相比,强迫游泳中的不动时间和组胺诱发的搔抓次数均明显减少(P<0.01);单纯氯胺酮注射可以使小鼠在强迫游泳中的不动时间明显减少(P<0.01),但对组胺引起的搔抓行为没有影响(P>0.05)。结论:本研究成功建立了小鼠的瘙痒与抑郁交互恶化模型,并观察到瘙痒与抑郁交互恶化的行为学表现,验证了氯胺酮在抗抑郁的同时也消除了抑郁所致的痒觉敏感性增加的现象,为后续相关机制的研究奠定了基础,为抑郁症和瘙痒症的综合防治提供了参考。第二部分CRH参与痒觉信息调控的机制研究目的:观察CRH是否参与痒觉信息的调控,并分析其受体机制。方法:(1)采用ELISA和行为药理学方法,观察短时间(3 min)的强迫游泳对急性痛与急性痒的抑制作用,并通过分析应激后不同时间段小鼠动脉血中CRH含量与痛、痒行为变化的对应关系,找到急性应激镇痛、抑痒的最有效时间段。(2)通过脑室内、鞘内、腹腔内、皮内注射等给药方式,结合小鼠的搔抓行为检测,观察外源性给予CRH对急、慢性痒的影响。(3)通过脑室内和鞘内给予CRH受体激动剂或拮抗剂,并结合搔抓行为检测,分析CRH参与痒觉调控的受体机制。(4)通过免疫荧光组织化学染色、原位杂交、Western-blot等方法,观察CRH及其受体在正常和DNFB慢性痒小鼠脊髓背角的表达。结果:(1)经ELISA检测,小鼠在急性应激(强迫游泳)后5-10 min时段内动脉血中的CRH达到峰值(P<0.01);对应时间段致痒剂所诱发的搔抓行为急剧减少(P<0.01),而机械痛阈值则显著增高(P<0.01)。(2)脑室内、鞘内、腹腔内注射CRH后:组胺或氯喹引起的搔抓行为受到明显抑制(P<0.01);鞘内、腹腔内注射CRH后,DNFB慢性痒模型小鼠的自发搔抓行为也明显减少(P<0.01);皮肤内注射高浓度CRH后,可引起自发搔抓行为,而且对组胺诱发的痒(组胺痒)有促进效应(P<0.05)。(3)脑室或鞘内注射CRH受体非特异性拮抗剂CRF9-41后,观察到CRF9-41可以完全逆转CRH对组胺痒的抑制作用(P<0.01),说明CRH对痒的抑制是通过CRH受体介导的。(4)鞘内注射CRH2受体(CRH2R)拮抗剂A-2B后,CRH对组胺痒的抑制作用不但消失,而且明显增强了组胺痒(P<0.05);而给予CRH1R拮抗剂NBI27914后,CRH对组胺痒的抑制作用不受影响(P>0.05)。提示,在脊髓水平,CRH可能分别通过CRH1R和CRH2R发挥促痒和抑痒作用。(5)脑室内注射CRH1R激动剂stresion-1的实验显示,高剂量(0.2 mol/L)导致小鼠出现抑郁样木僵(freezing)行为;低剂量(0.005 mol/L)则可明显促进组胺痒(P<0.01)。说明中枢内低剂量的CRH单独激活CRH1R可增加痒的敏感性。(6)Western-blot结果显示,DNFB涂抹引起慢性痒刺激后,小鼠脊髓背角CRH及其受体的表达显著提高;免疫荧光组织化学染色结果显示,DNFB模型鼠脊髓背角CRH的表达较对照组明显增加;原位杂交染色结果显示,DNFB模型鼠脊髓背角CRH1R的表达较对照组明显增加。提示,慢性痒可导致脊髓背角CRH及其受体的表达增加。结论:CRH及其受体CRH1R和CRH2R参与了对急、慢性痒的调控。急性应激后5-10 min,下丘脑等部位大量释放CRH入血,可显著抑制急性痛与急性痒。CRH2R可能主要介导了CRH对急慢性痒的抑制作用;CRH1R可能参与了CRH的促痒效应。