RNAi是由dsRNA触发的高度保守的基因表达调控机制,在植物和昆虫中,RNAi是一种主要的抗病毒防御机制。病毒进入宿主后,其复制过程中形成的dsRNA在宿主RNA酶ⅢDicer2的作用下,被切割成21-23nt的siRNA,siRNA随后被组装到RISC中,引导AGO2切割与其互补配对的mRNA,从而阻断病毒的复制。然而许多植物和动物病毒也进化出了RNAi的抑制子——VSR,来抑制宿主的抗病毒途径。这些VSR都是在病毒感染宿主过程中起到重要作用的蛋白,但它们在基因序列和病毒结构上并不保守,而且在RNAi机制中的作用位点也不相同。比如,FHV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以与dsRNA结合,阻止dsRNA被识别及剪切成siRNA。FHV B2蛋白也可以与siRNA结合,阻止RISC的组装。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通过与AGO2蛋白相互作用,阻止RISC的组装或作用于RNAi的效应阶段。而最近的研究发现,与AGO蛋白作用的一部分RNA干扰抑制子,通过保守的GW/WG motif与AGO蛋白结合,从而抑制RNAi应答。研究称,AGO蛋白中发挥与GW/WG motif结合功能是PIWI结构域。家蚕核型多角体病毒BmNPV是威胁蚕业生产的主要病毒,给蚕业生产带来巨大危害。为了促进对BmNPV的感染机制的了解,以开发应对之策,本篇研究对BmNPV能否抑制家蚕的RNAi进行了探索,并对其可能编码的RNA干扰抑制子进行了预测以及抑制子功能的鉴定。主要研究结果如下:1.BmNPV对BmN4-SID1和BmE细胞中RNAi的抑制作用的检测体外合成两条针对萤火虫荧光素酶的双链RNA——dsFluc1和ds Fluc2,将其与双荧光素酶报告基因共同转染BmN4-SID1细胞,对酶活的测定结果显示,两条dsRNA均抑制萤火虫荧光素酶的表达,即其均触发RNAi机制。而dsFluc2干涉引发的RNAi效应强于dsFluc1,因此选择dsFluc2进行实验。在未感染的BmN4-SID1细胞中,dsFluc2干涉引发的RNAi对萤火虫荧光素酶的沉默为dsRed的5倍,而在BV病毒感染的细胞中,这种基因沉默的现象基本得到回复,显示BmNPV可以抑制家蚕BmN4-SID1细胞中的RNAi过程。用dsFluc2与双荧光素酶报告基因共同转染BmE细胞,发现其对萤火虫荧光素酶的干扰为对照dsRed的27倍。而在BV病毒感染的细胞中,萤火虫荧光素酶基因的沉默也完全得到了回复,显示BmNPV同样可以抑制家蚕BmE细胞中的RNAi过程。因此,BmNPV编码RNAi的抑制子。2.对BmNPV中潜在的RNA干扰抑制子的预测研究用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的总蛋白中筛选含GW/WG motif的蛋白,分别得到2个、5个和5个含GW/WG motif的蛋白,发现已报道的这三个病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分别位于其中,证明可以用这种方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。对BmNPV中含GW/WG motif的蛋白进行筛选,共得到16个蛋白,按照功能不同将其分为四类:结构蛋白、复制和表达相关蛋白、宿主机体调节蛋白及其他功能蛋白。这些蛋白在病毒DNA的复制、完整病毒粒子的组装、病毒进入宿主以及子代病毒的释放等过程中分别显示出重要功能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣壳蛋白orf1629,38K和VP39是构成病毒粒子的主要蛋白,并在蛋白进入宿主和出芽过程中起重要作用。P47,DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的复制,影响病毒增殖。Cystein Protease,Chitinase和p35调节宿主细胞状态,病毒在宿主体内复制及组装完成后,需要借助于前两者对宿主机体的降解和液化来把释放子代病毒,而受感染的细胞为保护同伴,会启动“自杀”程序——细胞凋亡来阻止病毒大量扩增,p35则作用于抑制细胞凋亡过程,帮助病毒为所欲为地在宿主体内扩增,并且研究发现p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV组装及成熟子代病毒产生,PIF1介导ODV进入宿主细胞膜,P43功能未知。另外,用VSR预测网站对BmNPV的总蛋白进行预测,筛选出5个预测值最高的蛋白,分别是DNA Polymerase,ODV-E66,以及作用于病毒基因的复制和表达过程的IE-1和LEF-3,包膜蛋白orf14。3.抑制子候选基因对RNAi的抑制研究及BmAGO2-PIWI domain的表达本次研究对预测的14个基因进行克隆及表达载体的构建,分别是BmNPVp35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein protease、PIF1、orf1629、P47、P43、P48、orf4和VP39。对基因进行T克隆,测序验证正确后构建过表达载体,双酶切及测序验证正确显示过表达载体构建成功,得到pSLfa1180[Hr3-A4-Gene-SV40]。orf14通过Gateway方法构建到pie2FW载体中。向家蚕细胞中转染过表达载体,定量PCR检测显示目标基因均能在细胞中转录表达。初步选择9个候选基因进行鉴定,分别是IE1、orf4、P48、p35、LEF-3、orf1629、P47、VP39和P43。同样借助BmE细胞中ds Fluc2干涉对双荧光素酶报告基因中萤火虫荧光素酶基因的沉默现象,向细胞中同时转染过表达载体,Western Blot检测显示9个基因均在家蚕细胞中成功表达。检测其对萤火虫荧光素酶基因沉默的抑制效果,荧光结果显示,orf4、P48、P47和VP39分别造成BmE细胞中RNAi引发的沉默值下调67%、67%、53%和64%,其他基因对RNAi没有表现出明显的抑制效果。由此得出结论,orf4、P48、P47和VP39发挥着抑制家蚕RNA silencing效应的作用,初步鉴定为BmNPV的干扰抑制子,而其他基因并不发挥RNAi抑制子的功能。另外,由于一部分含GW/WG motif的RNA干扰抑制子通过与AGO蛋白的PIWI domain作用发挥功能,因此我们构建了BmAGO2-PIWI domain的原核及真核表达载体,可用来进行pull-down和免疫沉淀实验钓取BmNPV中的RNA干扰抑制子。