【背景】绝经后骨质疏松是最常见的骨质疏松,主要表现为绝经后出现的骨密度降低、骨微结构破坏和力学性能减退。可造成非应力性骨折高发,是危害中老年女性健康和生命的主要退行性疾病之一。骨质疏松发生的根本原因是破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成间的平衡破坏。以往对于骨质疏松的研究主要集中于终末分化的功能细胞。但近期研究发现,骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)作为成骨前体细胞的来源,在骨发育、改建和修复再生中均发挥重要作用。已有研究证实,在骨质疏松中BMSCs的成骨分化能力下降,是导致骨形成缺陷的重要原因。但是引起BMSCs分化功能异常的机制亟待阐明。最新研究表明,雌激素主要通过间接作用影响骨形成。雌激素对于辅助性T细胞等免疫细胞发挥重要的调控作用,其缺乏后引起的炎性因子增加是骨质疏松发生的关键致病因素。其中,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是最主要的炎性因子之一,通过基因敲除或中和抗体等方法抑制TNF-α可有效预防雌激素缺乏所致骨质疏松。此外,TNF-α已被证实可以抑制BMSCs的成骨分化,但是因为TNF-α作用广泛、下游信号通路复杂,其具体的分子信号途径尚不清楚。微小RNA(micro RNA,mi RNA)作为基因表达的重要调控手段,近年来被证实在BMSCs分化中扮演关键角色。现已发现多个mi RNA通过作用于成骨关键转录因子和信号分子调控BMSCs成骨分化进程。同时,在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等多种老年性疾病中均观察到特定mi RNA的表达变化,并参与了疾病的发生发展进程。但是骨质疏松过程中BMSCs中mi RNA表达是否发生改变,其改变与骨质疏松发生是否相关等重要问题均有待解答。【目的】本研究拟利用micro RNA高通量芯片检测技术,结合分子生物学和细胞生物学研究方法,探索TNF-α抑制BMSCs成骨分化的分子途径,明确mi RNA在其中的作用及机制,为深入认识绝经后骨质疏松的发生机制、探寻新的治疗靶点提供实验依据。【方法】1、通过卵巢切除(Ovariectomy,OVX)手术建立雌激素缺乏骨质疏松小鼠模型,利用micro CT和组织学检测明确其骨量变化;2、通过体外成骨分化实验,利用茜素红染色和Realtime RT-PCR检测成骨标志基因,明确OVX小鼠来源BMSCs成骨分化能力改变;3、利用ELISA检测明确TNF-α在OVX术后的水平变化;4、利用Western blot检测TNF-α下游激活的信号通路;5、利用si RNA阻断NF-κB信号通路进行缺失性功能研究;6、通过mi RNA高通量芯片筛查寻找在OVX及SHAM BMSCs中差异性表达的mi RNA;7、利用特定mi RNA mimics和inhibitor转染进行获得/缺失性功能实验,用以确定mi R-3077-5p和mi R-705在BMSCs分化中的作用;8、利用生物信息学分析寻找mi RNA作用的靶基因;9、采用Western blot检测结合荧光素酶报告系统验证mi RNA对靶基因的直接作用;10、利用雌激素体内注射和体外处理明确mi R-3077-5p和mi R-705是否直接受雌激素调控;11、利用重组TNF-α和TNF-α中和抗体体内注射,明确TNF-α对mi R-3077-5p和mi R-705表达的调控作用及其激活的信号通路;12、利用TNF-α体外处理,研究TNF-α调控mi R-3077-5p和mi R-705表达的分子信号机制;13、利用2’,7’-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)标记BMSCs内氧自由基(reactive oxygen species,ROS),并通过荧光显微镜和流式细胞术进行检测;14、利用抗氧化剂NAC明确ROS对于BMSCs成骨分化的作用;15、利用免疫组化检测骨质疏松后松质骨中叉头结合蛋白O亚家族1(FOXO1)的表达;16、利用Fox O1 si RNA干扰和慢病毒过表达技术,明确FOXO1在BMSCs抗氧化防御中的作用;17、通过antogomir体内注射体内下调mi R-705的表达,以体内验证mi R-705的功能及其作用靶基因;18、利用染色质免疫共沉淀技术明确NF-κB信号通路是否直接调控mi R-705的转录。【结果】1.骨质疏松中TNF-α抑制BMSCs成骨分化OVX术后3mon,BMSCs成骨分化能力较假手术组(Sham surgery,SHAM)显著下降。而血液中TNF-α水平在雌激素缺乏后明显上升,体外实验证实过量的TNF-α抑制BMSCs成骨分化。进一步信号通路检测发现TNF-α并不激活凋亡通路,而激活NF-κB信号通路。利用Ikka si RNA抑制NF-κB通路后可有效恢复OVX BMSCs的成骨分化,并阻断TNF-α对BMSCs成骨分化的抑制作用。2.TNF-α通过上调mi R-3077-5p表达抑制BMSCs成骨分化mi RNA高通量芯片筛查发现10个mi RNA在SHAM及OVX BMSCs中呈差异性表达,其中mi R-3077-5p差异最为显著。研究发现mi R-3077-5p在OVX BMSCs和骨组织中表达异常升高,雌激素治疗可降低其在骨组织中表达,但体外雌激素处理却促进mi R-3077-5p表达;而TNF-α显著促进mi R-3077-5p表达,说明雌激素缺乏后间接通过TNF-α提高mi R-3077-5p的表达。此外,mi R-3077-5p在骨组织中表达丰度高,随BMSCs成骨分化进程显著下降,功能学研究证实mi R-3077-5p抑制BMSCs成骨分化,主要通过直接结合于成骨关键转录因子Runx2 m RNA 3‘非翻译区(UTR)发挥作用。抑制mi R-3077-5p有效恢复OVX BMSCs的成骨功能低下,并部分拮抗TNF-α的抑制成骨分化作用。3.TNF-α通过导致氧化应激间接抑制BMSCs成骨分化通过体内外实验证实,骨质疏松中TNF-α的升高导致BMSCs中ROS水平升高,抑制BMSCs成骨分化。其氧化应激是由于SOD2、CAT等抗氧化酶表达减少、抗氧化防御缺陷所导致。FOXO1在骨质疏松骨组织及BMSCs中表达均下降。通过获得/缺失性功能实验证实FOXO1促进Sod2、Cat基因表达,发挥关键的抗氧化作用。TNF-α抑制FOXO1的蛋白表达,导致OVX BMSCs氧化损伤,而过表达FOXO1可减轻OVX和TNF-α所致的氧化损伤,恢复BMSCs的成骨分化功能。4.TNF-α通过上调mi R-705导致持续性氧化损伤TNF-α并不直接调控Fox O1基因转录。体内、体外实验证实TNF-α促进mi R-705表达。结合生物信息学分析、获得/缺失性功能实验、荧光素酶报告体系证实mi R-705可结合于Fox O1 m RNA 3‘UTR抑制其表达。下调mi R-705可提高BMSCs中FOXO1蛋白水平、Sod2和Cat m RNA表达,并减轻氧化损伤。信号通路研究证实TNF-α通过激活NF-κB信号通路,促进P65结合于mi R-705启动子激活其转录。此外,ROS能够进一步活化NF-κB通路提高mi R-705表达,形成NF-κB-mi R-705-FOXO1-ROS正反馈回路。TNF-α长期刺激可导致BMSCs持续性的氧化损伤和成骨分化缺陷。【结论】1.TNF-α是导致绝经后骨质疏松中BMSCs介导的骨形成缺陷的重要因素。雌激素缺乏后导致TNF-α水平升高,过量的TNF-α一方面通过抑制成骨关键转录因子Runx2的表达直接抑制BMSCs的成骨分化,另一方面通过抑制FOXO1介导的抗氧化防护机制,造成BMSCs氧化损伤,从而间接的抑制BMSCs成骨分化功能。2.绝经后骨质疏松来源BMSCs中部分mi RNA的表达发生显著改变,是导致BMSCs成骨分化异常的重要原因。而TNF-α可通过影响特定mi RNA的表达发挥抑制BMSCs成骨分化的作用。通过抑制其中mi R-3077-5p和mi R-705的过量表达,可有效拮抗TNF-α对BMSCs成骨分化的抑制作用,并恢复OVX BMSCs的成骨分化能力,提示mi RNA介导的转录后调控异常在绝经后骨质疏松发生发展中发挥重要作用。3.TNF-α通过NF-κB信号通路引起mi R-3077-5p表达升高,过量的mi R-3077-5p通过直接结合于Runx2 m RNA 3’UTR,从转录后调控水平降低RUNX2蛋白水平,直接抑制BMSCs成骨分化。4.TNF-α通过NF-κB通路激活mi R-705的转录,过多的mi R-705通过结合于Fox O1 m RNA 3’UTR区,抑制FOXO1蛋白表达,破坏SOD2和CAT介导的抗氧化防御并导致细胞氧化应激损伤;并且TNF-α长期刺激可激活NF-κB-mi R-705-FOXO1-ROS正反馈回路,导致持续性的氧化损伤,持久破坏BMSCs介导的骨形成。