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背景和目的胶质瘤是原发颅内恶性肿瘤,仍是神经外科医学的重点和难点具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低等特点。传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗等方法,近几年开展胶质瘤精准定位切除和联合放疗等方法,但治愈率仍不理想。分子精准治疗成为研究的新方向,为治愈胶质瘤带来的新的希望。随着近年来胶质瘤干细胞研究的不断进展,越来越多的研究者认为胶质瘤干细胞样细胞是胶质瘤发生发展的根本原因。GSCs的发现可追溯到2002年,当研究者将神经胶质瘤细胞进行体外培养时,发现肿瘤细胞中有类似神经干细胞样的细胞。2004年后,研究者利用不同的细胞表面标志,从神经胶质瘤细胞中均富集得到了 GSCs。这些表面标志包括:CD133、CD15/SSEA-1、L1CAM、A2B5 和整合素 6(integrin 6)等。要想彻底的根治胶质瘤,必须铲除胶质瘤发生发展的根源,也就是说必须消灭胶质瘤干细胞才能根治胶质瘤。为了抑制胶质瘤干细胞在肿瘤发生发展中的功能,取得更为理想的疗效,国内外研究者采取了多种针对性策略,如抑制增殖、促进分化、诱导凋亡和增强放疗敏感性等。文献报道,肿瘤干细胞功能的维持依赖于Wnt、Shh和Notch等细胞信号通路,人端粒酶(hTERT),Oct3/4、Nanog、Sox2等因子。抑制上述信号通路和人端粒酶(hTERT)的活性将严重影响肿瘤干细胞自我更新,多向分化等特性。Piccirillo等应用外源性BMP蛋白诱导GSCs发生分化,导致整个肿瘤群体的成瘤能力严重下降。Zhang等使用溶瘤腺病毒ONYX-411携带能沉默突变型K-ras的siRNA 转染胰腺癌等癌细胞,能有效促进肿瘤细胞凋亡。Bao等研究发现,胶质瘤干细胞与非干细胞样胶质瘤细胞相比,能更有效地启动DNA损伤修复反应,减少射线对其造成的伤害;进一步研究发现通过抑制细胞周期检测点激酶Chk1和Chk2的活性,有效地削弱了胶质瘤干细胞耐放疗性,恢复对放疗的敏感性。胶质瘤干细胞及胶质瘤的进展涉及到多种基因突变,近年来研究最广泛的是非编码RNA的调控作用,特别是长链非编码RNA在胶质瘤生长、发展中所起的作用不容忽视。长链非编码RNA(LncRNA)是核苷酸序列>200nt的核苷酸序列,通过表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等几个方面来影响下游蛋白的形成,参与调控胶质瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡能力的改变。部分研究已经证明了 LncRNA在胶质瘤细胞的生长过程中扮演重要角色:LncRNA HOXA-AS3在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中表达水平高于非瘤脑组织。在胶质瘤细胞中,下调LncRNA HOXA-AS3表达水平可以抑制细胞增殖能力,促进细胞凋亡;在胶质瘤细胞中,下调LncRNA HOX的表达水平可以抑制细胞的增殖和侵袭能力,促进细胞的凋亡能力。还有LncRNAMALAT1、LncRNA HOXA11-AS、LncRNAXIST和LncRNAMEG3等等长链非编码RNA均影响胶质瘤细胞生物学功能。LncRNA-ZNF281是一类新型长链非编码RNA,其核苷酸长度是353nt,位于染色体1q32.1。在我们的前期实验研究中发现lncRNA-ZNF281可以通过调控VEGF和MMP2的表达抑制胶质瘤细胞株U87,SHG139的侵袭能力,但是胶质瘤干细胞的影响未做进一步研究。本实验中,我们将研究LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞的调控作用,为lncRNA-ZNF281作为新的靶点治疗胶质瘤提供新的科学依据。一、材料和方法1.来源于胶质瘤细胞株U251的胶质瘤干细胞U251s的分离、培养及干细胞特性的鉴定。2.胶质瘤干细胞U251s与胶质瘤细胞株U251不同侵袭能力及侵袭相关蛋白的表达检测。3.采用实时定量PCR检测lncRNA-ZNF281在胶质瘤组织、胶质瘤干细胞U251s、胶质瘤细胞株U251及正常脑组织中的表达。4.设计lncRNA-ZNF281过表达序列,由苏州吉玛生物公司合成及构建lncRNA-ZNF281过表达慢病毒。5.免疫荧光、二次成球、定量PCR法、western-blot检测lncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞U251s干性特征的影响(检测相关胶质瘤干细胞表面分子标记物的表达及自我更新能力)。6.Transwell实验在体外检测lncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞U251s侵袭能力的影响及Western blot法检测lncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞U251s侵袭相关信号通路NF-κ B相关蛋白的表达影响。7.构建裸鼠皮下移植瘤模型,通过测量裸鼠皮下移植瘤的大小验证LncRNA-ZNF281对裸鼠体内肿瘤生长的影响。8.构建裸鼠移植瘤颅内模型,HE染色检测裸鼠颅内成瘤情况;免疫组化检测体内肿瘤中增殖相关蛋白Ki-67、信号通路NF-κ B相关蛋白及侵袭相关蛋白MMP2的表达情况;9.应用SPSS 18.0软件进行数据分析,用均值±标准差来表示数据。两组数据之间的比较是使用t检验进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。二、结果1.胶质瘤干细胞U251s的培养与鉴定为了研究胶质瘤干细胞的特征,我们采用逆转培养法从胶质瘤细胞株U251中分选得到了胶质瘤干细胞样细胞U251s。通过免疫荧光技术及RT-qPCR技术检测胶质瘤干细胞U251s的干细胞表面标记物CD133、A2B5、Nestin、SOX2、OCT4、Nanog的蛋白及mRNA水平的表达,我们发现我们培养的胶质瘤干细胞高表达干细胞标记物;同时二次成球实验证明胶质瘤干细胞样细胞U251s具有自我更新能力。2.胶质瘤干细胞侵袭能力的分析我们采用体内外实验验证相较于普通胶质瘤细胞株U251,胶质瘤干细胞U251s是否具有更强的侵袭特性,我们通过检测相关侵袭蛋白的表达结果显示侵袭相关蛋白的表达明显升高;同时颅内移植瘤实验(使用由美国周一红教授赠予本研究室的携带不同荧光的两组胶质瘤细胞)证明在裸鼠颅内移植瘤实验中胶质瘤干细胞U251s相较于胶质瘤细胞株U251具有更强的播散能力。3.LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞干性特征的影响为了验证LncRNA-ZNF281是否在胶质瘤的发生发展及胶质瘤干细胞的功能方面发挥作用,我们首先检测了 LncRNA-ZNF281在胶质瘤组织、胶质瘤细胞及胶质瘤干细胞中的表达,结果显示LncRNA-ZNF281在胶质瘤组织中的表达明显低于正常脑组织,且在胶质瘤干细胞中的表达明显低于胶质瘤细胞中的表达,这提示我们LncRNA-ZNF281可能在胶质瘤干细胞中发挥重要的作用;随后我们设计构建了LncRNA-ZNF281过表达慢病毒,转染胶质瘤干细胞U251s,然后我们采用免疫荧光法、western-blot法、RT-qPCR法检测lncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞U251s干细胞表面标记物(CD133、Nestin、OCT4、SOX2、Nanog)表达的影响,结果表明lncRNA-ZNF281可以明显减弱胶质瘤干细胞标记物(CD133、Nestein、OCT4、Nanog)的表达。同时我们采用二次成球实验检测LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞U251s的自我更新能力的影响,我们发现转染LncRNA-ZNF281过表达慢病毒后,胶质瘤干细胞U251s的自我更新速率明显降低。说明LncRNA-ZNF281在体外过表达后可以有效抑制胶质瘤干细胞U251s的增殖能力(自我更新能力)。4.LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞侵袭能力的影响胶质瘤干细胞相较于胶质瘤细胞株具有更强的侵袭能力是胶质瘤干细胞的一大特性,为了探讨LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞侵袭能力的影响,体外实验中我们使用transwell小室进行实验检测其对侵袭能力的影响,结果显示LncRNA-ZNF281可以有效抑制胶质瘤干细胞的体外侵袭能力;并通过western-blot检测相关侵袭蛋白的表达,探讨lncRNA-ZNF281的作用机制,结果显示LncRNA-ZNF281可以通过抑制NF-κ B信号通路及侵袭相关蛋白MMP2的表达从而抑制胶质瘤干细胞的侵袭能力。5.体内实验验证LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞侵袭及成瘤能力的影响将LncRNA-ZNF281 U251s和LncRNA-NC U251s两组细胞建立皮下移植瘤模型,测量肿瘤生长速度,验证LncRNA-ZNF281在体内对胶质瘤干细胞自我更新能力的抑制作用,结果显示LncRNA-ZNF281可以明显抑制皮下移植瘤的生长速度;同时构建颅内移植瘤模型,采用免疫组化检测相关蛋白的表达,结果发现LncRNA-ZNF281 U251s组中侵袭相关蛋白MMP2的表达较LncRNA-NC U251s组明显降低,差异具有统计学意义。三、结论LncRNA是一类长链非编码RNA,其核苷酸序列长度大于200nt。近几年的研究发现,LncRNA在各类肿瘤中均起着重要的调控作用,如:LncRNA ATB对骨肉瘤的增殖和侵袭产生重要的调控作用;LncRNA CRNDE在结肠癌的生长、发展过程中起重要调控作用,LncRNA RGMB-AS1影响肺癌的侵袭能力,等等。在胶质瘤中,大量的LncRNA也已被证明扮演着重要的角色。LncRNA-ZNF281是一类新型长链非编码RNA,其核苷酸长度是353nt,位于染色体1q32.1。在我们的前期实验研究中发现lncRNA-ZNF281可以通过调控VEGF和MMP2的表达抑制胶质瘤细胞株U87,SHG139的侵袭能力,但是胶质瘤干细胞的影响未做进一步研究。本实验中,我们将研究LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞样细胞的调控作用。为验证LncRNA-ZNF281对胶质瘤干细胞的调控作用。我们首先通过逆转培养法从胶质瘤细胞株U251中得到了胶质瘤干细胞U251s,并对其干细胞特征及自我更新能力进行了鉴定。同时我们检测了胶质瘤干细胞U251s及胶质瘤细胞株U251两组细胞的侵袭能力,结果显示胶质瘤干细胞U251s具有更强的侵袭性。我们的实验数据证明,LncRNA-ZNF281在胶质瘤干细胞U251s中的表达水平低于胶质瘤细胞株U251;因此,我们推测LncRNA-ZNF281在胶质瘤干细胞的维持及侵袭中可能发挥着重要作用。在本实验中,我们通过体外实验证实了 LncRNA-ZNF281可以抑制胶质瘤干细胞U251s的干性特征及侵袭能力,同时检测了侵袭相关NF-κ B信号通路及侵袭相关蛋白MMP2的表达,发现LncRNA-ZNF281可能主要通过影响NF-κ B信号通路发挥作用;在体内试验中证实LncRNA-ZNF281可以通过NF-κ B信号通路有效抑制胶质瘤干细胞U251s的增殖及侵袭能力,这为lncRNA-ZNF281作为新的靶点治疗胶质瘤提供新的科学依据。