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目的探讨瘦素(Leptin)促人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表达及其诱导上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制,初步阐明Leptin通过上调糖代谢关键酶PKM2而影响乳腺癌EMT及其作用机制。方法1.采用蛋白质印记法(western blotting,WB)和免疫荧光法(immunofluorescence,IF)检测人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468中Leptin长受体OB-Rb、短受体OB-Rt的表达;采用人源Leptin处理三株细胞,观察细胞形态变化;WB检测细胞EMT相关标志蛋白的表达。2.Leptin处理人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3后,采用QRT-PCR和WB,分析PKM2 m RNA及蛋白水平的变化。3.采用化学合成的PKM2-si RNA干扰乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2,划痕及Transwell侵袭实验分别检测Leptin对两株细胞迁移及侵袭能力的影响;WB检测Leptin对两株细胞EMT相关标志蛋白表达的影响。4.采用Leptin联合PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK/ERK1/2信号通路抑制剂处理乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3,WB检测PKM2的表达。采用Leptin受体中和抗体处理乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3后,WB检测Leptin对PKM2表达及对PI3K/AKT信号通路激活的影响;采用WB检测PI3K/AKT通路抑制剂处理后,乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3中PKM2及EMT相关蛋白的表达。5.构建稳定干扰PKM2的乳腺癌SK-BR-3细胞株,利用该细胞株建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤大小,观察裸鼠生存期。免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测肿瘤组织EMT相关蛋白的表达,HE染色检测肿瘤肝肺转移。结果1.WB及IF结果表明,乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-468均表达OB-Rb和OB-Rt;Leptin能引起三株细胞形态发生EMT样改变,且下调上皮性标志物E-cadherin,上调间质性标志物Vimentin和Fibronectin的表达。2.QRT-PCR及WB结果显示,Leptin能显著上调MCF-7、SK-BR-3细胞PKM2的m RNA及蛋白水平。3.为进一步探讨PKM2在Leptin促乳腺癌细胞EMT过程中的作用,采用PKM2-si RNA干扰细胞表达PKM2,划痕及Transwell实验结果表明,MCF-7、SK-BR-3细胞的迁移和侵袭能力被抑制;WB检测提示,细胞的E-cadherin水平升高,Vimentin、Fibronectin水平降低,即干扰细胞PKM2表达后Leptin促EMT作用被抑制。4.WB结果表明,抑制PI3K/AKT信号通路能减弱Leptin促PKM2表达的作用。采用中和性抗体封闭Leptin受体OBR,PI3K/AKT信号通路的激活被抑制,Leptin促PKM2表达的作用也被抑制。采用WB检测发现PI3K/AKT信号通路抑制后,Leptin促乳腺癌细胞PKM2表达及EMT的作用被抑制。5.裸鼠乳腺癌移植瘤模型分为SKBR-3、SKBR-3-LV和SKBR-3-sh PKM2组,其中SKBR-3、SKBR-3-LV为对照组,SKBR-3-sh PKM2为实验组。实验结果表明SKBR-3-sh PKM2组肿瘤体积、重量均明显小于对照组。HE染色SKBR-3、SKBR-3-LV组肝肺转移灶较SKBR-3-sh PKM2组明显增多。瘤组织IHC结果显示,与对照组相比,SKBR-3-sh PKM2组E-cadherin表达明显升高,Vimentin、Fibronectin表达明显降低,SKBR-3-sh PKM2组小鼠生存期明显延长。结论1.Leptin促进乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468发生EMT。2.Leptin激活PI3K/AKT信号通路上调乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2表达,进而促进乳腺癌细胞发生EMT。3.抑制PKM2能够减弱乳腺癌细胞移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠生存期,减少乳腺癌肝肺转移,PKM2可能是影响乳腺癌侵袭转移的重要靶点。