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自20世纪60年代末,在免疫学、生物化学、内分泌学等学科的基础上,逐渐兴起了一门边缘学科——激素免疫学,为调控动物繁殖提供了新的思路。近年来,国内外一些学者研究发现,抑制素免疫对猪、牛、羊等家畜生殖功能有着重要的调节作用,具有提高动物繁殖力的潜能,但抑制素免疫目前存在免疫原制备困难,免疫效果不甚理想等问题。为了寻找免疫效果好的免疫原,本研究应用基因重组的方法,在大肠杆菌中成功表达出新疆细毛羊抑制素α亚基成熟片段基因,获得了含有两个抗原决定簇的抑制素融合蛋白,并首次用新疆细毛羊抑制素α亚基成熟片段基因的重组融合蛋白免疫SD大鼠,研究该疫苗对大鼠生殖激素及卵泡发育的影响和该蛋白疫苗的剂量效应,为该蛋白疫苗将来在畜牧生产中的实际应用打下坚实的基础。首先,实验选择10只性成熟的体重均为200g左右的雌性SD大鼠,随机分为免疫组和对照组,每组5只。以实验当天为0天,免疫组在0,14和28天分别免疫1mLINHα亚基重组融合蛋白疫苗(含免疫原1.0mg),共免疫三次,对照组使用PBS免疫。免疫均采用颈部皮下多点注射法,初次免疫使用弗氏完全佐剂,加强免疫使用弗氏不完全佐剂。每次免疫前采集血样,第3次免疫后6天,每6h采集血样一次,连续采集4天(一个发情周期)。血清抗体滴度用ELISA方法检测,血液中生殖激素(FSH,LH,P)含量用RIA法测定。血清中抗体检测结果显示,免疫后血液抗体滴度(P/N值)逐渐升高,免疫后28天抗体水平达到最大(P/N值=6.62±0.66),显著高于免疫后14天水平(P/N值=2.27±0.29)(P＜0.05),而后一直维持在较高水平;发情周期内生殖激素检测发现,FSH分泌高峰出现在发情周期的24h,免疫后FSH分泌峰值增高,血清含量为28.25±0.83mIU/mL,显著高于对照组水平(12.47±2.71mIU/mL)(P＜0.05),且INHα亚基重组融合蛋白免疫后,免疫组外周血中FSH平均水平(13.83±0.79mIU/mL)也显著高于对照组平均水平(5.36±0.57mIU/mL);而免疫组与对照组LH分泌高峰时血液中LH含量分别为:14.91±1.45mIU/mL和14.20±0.76mIU/mL,统计分析差异均不显著(P＞0.05);免疫后P分泌峰值增高,免疫组血清P含量为51.34±9.30ng/mL,显著高于对照组高峰时P含量(30.86±0.92ng/mL)(P＜0.05)。其次,为研究INHα亚基重组融合蛋白疫苗的剂量效应,我们将25只性成熟的体重均为200g左右的雌性SD大鼠随机分为5组,每组5只,实验1-4组分别免疫浓度为0.1mg/mL,0.5mg/mL,1.0mg/mL和2.0mg/mL的INHα亚基重组融合蛋白疫苗1mL,对照组使用PBS注射。以实验当天为0天,分别在实验的0天,14天和28天免疫,共免疫三次,免疫采用颈部皮下多点注射法,初次免疫使用弗氏完全佐剂,加强免疫使用弗氏佐剂。每次免疫前采集血样,第三次免疫后6天,每6h采集血样一次,连续采集4天(一个发情周期)。血清抗体水平应用ELISA方法检测,发情周期内血样的激素水平(FSH,LH,P含量)应用RIA方法测定。结果显示:(1)抗体检测发现,免疫后各组抗体水平逐渐升高,免疫后28天各组抗体水平达到最高,0.1mg,0.5mg,1.0mg和2.0mg剂量组抗体水平(P/N值)分别为:2.49±0.70,2.55±0.34,6.62±0.66,3.72±0.85,统计分析显示1.0mg组P/N值显著高于其他组(P＜0.05),其余各组彼此无显著差异;(2)发情周期内血清激素检测发现,大鼠FSH分泌高峰出现在发情周期的24h,不同剂量INHα亚基重组融合蛋白免疫大鼠后,0.1mg,0.5mg,1.0mg和2.0mg剂量组分泌高峰时血清FSH含量分别为:19.70±4.55mIU/mL,23.21±7.50mIU/mL,28.25±0.83mIU/mL,31.68±6.85mIU/mL,对照组为12.47±2.71mIU/mL,统计分析显示,1.0mg和2.0mg剂量组显著高于0.1mg、0.5mg和对照组(P＜0.05),发情周期内1.0mg和2.0mg剂量组血清FSH平均含量分别为13.83±0.79mIU/mL和13.94±0.67mIU/mL,显著高于0.1mg、0.5mg和对照组的平均水平(5.74±0.77mIU/mL,7.10±0.83mIU/mL和5.36±0.57mIU/mL)(P＜0.05),1.0mg和2.0mg两组之间发情周期内血清FSH含量无论是峰值还是平均水平都无明显差异;血清LH含量分泌高峰(发情周期的18h)时分别为:11.90±0.92mIU/mL,12.67±0.39mIU/mL,14.91±1.45mIU/mL,14.79±1.36mIU/mL,对照组为14.20±0.76mIU/mL,统计分析各剂量组LH分泌无明显差异(P＞0.05);P分泌高峰与LH一致,出现在发情周期的18h,抑制素免疫后发情周期内峰值处血清P含量增大,免疫剂量越大峰值越高,各剂量组(0.1mg,0.5mg,1.0mg和2.0mg)峰值处血清P含量依次为40.53±8.66ng/mL,38.10±6.73ng/mL,51.34±9.30ng/mL,52.13±3.77ng/mL,对照组为30.86±0.92ng/mL,统计分析各组含量,1.0mg和2.0mg剂量组显著高于其他组(P＜0.05),1.0mg和2.0mg剂量组之间无显著差异;(3)卵巢发育观察发现,不同剂量抑制素α亚基三次免疫大鼠后,大鼠卵巢上成熟卵泡个数增加,并随剂量的增加而增多。免疫剂量为1.0mg时,大鼠卵巢上成熟卵泡(直径≥0.8mm)数为31.0±2.65个,显著高于0.5mg,2.0mg剂量组和对照组(20.4±2.31个,22.25±3.42个和15.33±0.67个)(P＜0.05)。从外部形态看免疫后大鼠卵巢发育正常,有腔卵泡明显,分析免疫组的抗体水平与卵泡发育的相关性,发现抗体水平与卵巢上成熟卵泡数呈极显著相关(r=0.73,P＜0.01),成熟卵泡数与卵泡重等相关性不显著。上述研究结果证实,INHα亚基重组蛋白疫苗免疫SD大鼠后无论抗体水平、激素水平还是卵泡发育等指标免疫组均不同程度的高于对照组,为此揭示新疆细毛羊INHα亚基成熟片段基因的重组蛋白疫苗对SD大鼠具有良好的免疫效果。剂量效应实验表明,在本研究的剂量范围内,表现出明显的剂量效应,剂量为1.0mg时免疫效果最佳,这为进一步研究抑制素免疫和为该疫苗在实践中应用打下了坚实的基础。