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目的:探究人脐带间充质干细胞衍生的外泌体对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型的炎症缓解、抗氧化应激及促进巨噬细胞活化的作用。方法:(1)分离及鉴定新生儿的脐带组织间充质干细胞衍生的外泌体(Mesenchymal stem cells-derived exosomes):收集正常分娩的新生儿脐带,将脐带组织剪为适度大小的组织块,在专用的间充质干细胞培养基中,根据组织块贴壁法培养细胞,定期于显微镜下观察,细胞持续生长直至融合达70-80%,然后收集用于下一步实验。直至第5代时收集MSCs培养上清液,在4℃条件下经超速离心提取外泌体,免疫印迹法(western blot,WB)检测膜蛋白抗原(CD9,TSG101等),电镜检测纳米颗粒和纳米粒子跟踪分析囊泡大小。(2)体外实验探究MSC-EVs对格兰阴性杆菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞的活化作用:将细胞随机分为对照组、LPS组和LPS+MSC-EVs组。LPS+MSC-EVs组在无血清培养基中用MSC-EVs(10ug/ml)预处理12h以确保摄取,然后用100ng/ml LPS刺激12h以诱导LPS组和LPS+MSC-EVs组巨噬细胞活化,而后用Western blot法检测各组细胞内TLR4、TNF-α、IL-1β蛋白的表达水平。(3)体内实验构建小鼠急性肺损伤(acute Lung injury,ALI)动物病理模型:45只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、ALI模型组及ALI+MSC-EVs治疗组,通过气管内给药的方式将生理盐水、LPS、MSC-EVs按分组情况注入小鼠肺部,造模后密切观察小鼠的一般情况,分别于模型成功后24h、4d、14d麻醉及灌注后处死小鼠并收集小鼠肺组织。(4)取24h、4d、14d各组小鼠左肺行HE染色,明确肺部病变情况,了解MSC-EVs是否起到了对ALI的治疗作用。(5)根据HE染色结果的初判后,进行m RNA测序分析,主要选用4d时的各组小鼠部分右肺组织,并依照所筛选出的差异基因完善GO富集和KEGG富集,探究MSC-EVs是通过何种因子及通路以及生物学效应起到对ALI的治疗作用。(6)结合HE染色及m RNA测序分析,选取4d、14d各组小鼠部分右肺组织行蛋白免疫印迹法检测Nrf2、Keap1、HO-1、TLR4、NF-κB p65、i NOS、Arg1的分子表达情况。结果:(1)分离出的MSC-EVs在透射电镜下观察形态为椭圆形的囊泡,Western blot法检出CD9及TSG101较MSC特异性表达,说明收集到的外泌体符合鉴定标准,可以进行后续实验。(2)在体外实验中,RAW264,7细胞摄取外泌体。与空白对照相比模型组的TLR4、IL-1β以及TNF-α表达水平明显增高(p<0.05),而于LPS组相比LPS+MSC-EVs组各因子表达水平则显著降低(p<0.05)各组间差异均含统计学意义。(3)在体内实验中,各组HE染色情况可发现,对照组肺泡壁未见增厚、肺泡间隔无充血及变宽,无炎性渗出。疾病模型组肺泡壁所含毛细血管扩张最严重,肺泡壁充血,肺泡内大量炎性细胞浸润,MSC-EVs治疗组情况介于对照组和急性肺损伤组之间。与对照组比较急性肺损伤组小鼠肺组织损伤评分明显增高,MSC-EVs治疗组肺组织损伤评分较ALI组明显降低,且上述症状在4d时表现最为明显。(4)m RNA测序显示,(1)以差异倍数(FC)绝对值>2且P<0.05为标准,筛选差异表达m RNA。共选出上调m RNA154个和下调m RNA68个,筛选出的差异基因包含了大量的涉及免疫调节机制及氧化还原机制的基因,诸如TLR4、Arg1、HO-1等;(2)通过GO功能富集分析,对生物过程(biological process),细胞成分(cellular component),分子功能(molecular function)三个层次上对应的差异基因数目进行统计,结果显示所筛选出的差异表达基因主要存在于55个GO条目。涉及生物过程的占绝大多数,包含了免疫反应、急性炎症反应的正调控等,细胞成分中细胞器、细胞膜、细胞内囊泡、囊泡均有富集,而对分子功能层面则主要富集于趋化因子活性、半胱氨酸型肽酶活性等;(3)KEGG通路富集分析后,发现差异表达基因主要富集于免疫机制、信号转导机制内的151条KEGG通路,包括Toll受体信号通路、甲型流感病毒通路、NOD受体信号通路等。(5)Western blot法可见,4d时与对照组相比ALI模型小鼠肺组织内Nrf2、HO-1、Arg1的表达有所上升(p<0.05),与ALI模型组相比ALI+MSC-EVs组上述分子的表达更显著提高(p<0.05);而与sham组相比Keap1、TLR4、NF-κB p65、i NOS等分子在ALI模型小鼠肺组织内的表达显著增高(p<0.05),在给予了外泌体治疗后这四个分子的表达含量降低(p<0.05),差异均含有统计学意义。但是在14d时,除过Nrf2,其余分子差异均不具有统计学意义。考虑可能与体内构建的肺损伤模型病程具有自限性有关。结论:实验成功构建了肺损伤动物及细胞模型,并结合我们的实验结果表明脐带间充质干细胞衍生的外泌体,其主要是依赖巨噬细胞的M2型活化,通过转录因子E2相关因子信号通路及Toll样受体4/核因子κB信号通路发挥对脂多糖诱导的C57BL/6小鼠急性肺损伤的抗氧化和抗炎作用。