第一部分Nurr1和Brn4基因转染对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响目的:观察体外Nurr1和Brn4基因转染对大鼠中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化和成熟的影响。方法:1.通过RT-PCR方法从大鼠脑组织中克隆Nurr1与Brn4基因的cDNA全长序列,酶切后分别连接到pEGFP-N1与pDsRed-N1质粒载体中,经转化、筛选和鉴定等步骤构建pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4真核表达载体。2.采用无血清培养技术从孕14天胎鼠的中脑组织中分离培养神经干细胞,用Nestin和BrdU标记及免疫荧光检测验证其胚胎源性和分裂增殖能力,分别用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性标记物MAP-2、GFAP和CNP免疫荧光细胞化学检测验证其多分化潜能。3.将神经干细胞分成4组进行转染,对照组转染空质粒载体pEGFP-N1;Brn4组转染重组质粒载体pDsRed-N1-Brn4 ; Nurr1组转染重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1;Nurr1+Brn4组同时转染重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4。将各组转染后的细胞在体外诱导分化,通过检测质粒载体中荧光蛋白报告基因的表达评价转染效率,应用Western blot和实时PCR等方法检测目的基因的表达效果。诱导分化3周后分别用MAP-2、DAT和TH免疫荧光双标记技术检测神经干细胞分化为多巴胺能神经元的情况,并测量TH阳性细胞的胞体面积和细胞周长,用高效液相色谱仪检测细胞分化培养液中多巴胺的释放水平。结果:1.从大鼠脑组织中克隆到Nurr1与Brn4基因的全长序列,经基因重组后获得pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4真核表达载体。2.胎鼠中脑细胞悬液培养1周后可形成由数百个细胞组成的呈悬浮生长的神经球,经BrdU和Nestin免疫荧光检测均呈阳性。神经球中的细胞诱导分化后出现MAP-2、GFAP和CNP阳性的神经系统三种类型细胞,其中分化的星形胶质细胞数量最多,神经元次之,少突胶质细胞最少。3.荧光显微镜下观察发现,pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4质粒转染神经干细胞6-8小时后即可见荧光蛋白表达,转染后48小时表达最明显,随后荧光逐渐减弱减少,至3周左右基本消失。荧光照片经图像分析得出基因转染效率为35%左右,两种质粒共转染没有竞争性抑制作用。4. Western blot和实时定量PCR结果分析显示,重组质粒转染后目的基因的表达量明显升高,pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4两种质粒共转染后Nurr1和Brn4的表达没有叠加效果。5.免疫荧光检测结果显示,对照组和Brn4组中TH阳性神经元很少,分化率约为3%,细胞形态不成熟,表现为TH多集中在胞体内表达,细胞胞体较小,突起少而短。TH阳性神经元极少共表达DAT;Nurr1组TH阳性神经元明显增多,分化率为16.5%,但细胞形态也欠成熟,细胞突起很少。TH阳性神经元也很少共表达DAT;Nurr1+Brn4组TH阳性神经元最多,分化率为17%,而且细胞形态较成熟,TH在胞体和突起中均有表达,细胞胞体较大,突起细长丰富,局部交织成网状。TH阳性神经元大多数能共表达DAT。6.高效液相色谱分析显示,对照组和Brn4组的培养液中多巴胺含量很低,Nurr1组多巴胺含量略有升高,Nurr1+Brn4组多巴胺含量最高,达到3.40μg/ml。结论:1.从鼠胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞。2. Nurr1基因过表达能促进神经干细胞向TH免疫阳性的多巴胺能神经元分化,但产生的细胞欠成熟;Brn4基因不能诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化,但Nurr1联合Brn4基因共转染能促进神经干细胞向形态、表型、功能成熟的多巴胺能神经元分化。第二部分转基因神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究目的:观察转基因的神经干细胞移植入帕金森病(PD)大鼠模型损毁侧纹状体后存活、分化和发挥生理功能的情况。方法:1.应用脑立体定位技术单点注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)至大鼠右侧前脑内侧束制备单侧PD大鼠模型。然后应用阿朴吗啡(APO)诱发旋转试验验证模型是否成功,并行脑组织切片Nissl染色和TH免疫组织化学染色验证模型的可靠性。2.将成功PD大鼠模型随机分为4组进行移植,假手术组不移植神经干细胞;NSCs组移植未转染的神经干细胞;Nurr1组移植转染pEGFP-N1-Nurr1的神经干细胞;Nurr1+Brn4组移植联合转染pEGFP-N1-Nurr1和pDsRed-N1-Brn4的神经干细胞。各组神经干细胞用DIL标记后在脑立体定位下进行移植。用APO腹腔注射诱发旋转试验观察移植后大鼠行为的改善情况。移植后12周脑组织切片行TH免疫荧光检测移植细胞分化为多巴胺能神经元的情况,用高效液相色谱仪检测移植侧纹状体中多巴胺的含量。结果:1. PD模型大鼠出现典型的旋转行为,旋转速度超过210圈/30分钟的占全部实验动物的61%,连续观察20周旋转速度并不随时间推移而下降;Nissl染色见损毁侧黑质致密部神经元数量锐减;TH免疫组化染色见损毁侧黑质致密部TH阳性细胞大部分消失,损毁侧纹状体内TH免疫反应性降低,TH免疫阳性纤维明显减少。2.移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转行为没有明显改善,旋转圈数随时间先逐渐增加,至10周左右达到一稳定水平;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数不再进一步增加,而且从6周开始略有下降;Nurr1+Brn4组移植后PD大鼠的旋转行为明显改善,旋转圈数随时间推移逐步下降,但至12周末仍没有达到正常水平。3.免疫荧光结果显示,NSCs组可见DIL阳性细胞,但只有极少数呈TH阳性;Nurr1组可见较多DIL/TH双标神经元,但TH阳性神经元的突起少而短;Nurr1+Brn4组DIL/TH双标神经元最多,且TH阳性神经元形态较成熟,细胞突起较多较长。4.假手术组和NSCs组纹状体中DA含量较低,Nurr1组和Nurr1+Brn4组DA含量显著升高,其中Nurr1+Brn4组含量最高,达到7.33μg/ml,但仍然明显低于正常大鼠纹状体内的DA含量。结论:Nurr1基因过表达能诱导神经干细胞在体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上提高移植区多巴胺的含量、改善大鼠的行为功能;Brn4能提高移植区多巴胺能神经元的存活率。联合转染Nurr1和Brn4基因的神经干细胞移植后能产生更多的TH阳性的多巴胺能神经元,显著提高移植区多巴胺含量,有效地改善大鼠的行为症状。