背景：脑血管病是临床上比较常见和多发的疾病，有较高的死亡率、致残率。其最常见的病因是高血压。研究显示，局灶脑缺血后大约有80%的人会留下不同程度的后遗症，为社会和家庭带来了沉重的负担。研究者们不断致力于减少或减轻局灶脑缺血带来的神经功能损害的后遗症。局灶脑缺血/再灌注损伤后，导致炎症介质“瀑布”式的释放，引起血管、神经损坏。因此，早期促进血管再通和再生，促进神经轴突或神经元的再生是减少后遗症的关键。血管生成有三种形式，即血管发生、动脉形成和血管生成。以前认为个体出生后血管的产生机制是“血管发生”,即血管已经存在的内皮细胞的增殖和迁移形成心血管。但是，血液中内皮祖细胞（endothelialprogenitor cells，EPCs）EPCs的分离使我们认识到新的机制——血管生成，即来源于骨髓的EPCs增殖、趋化、分化，形成新血管。研究显示，局灶脑缺血/再灌注损伤后局部eNOS分泌增多，而eNOS增多后能促进EPCs动员、转移和归巢。PI3K/Akt是eNOS的上游通路，影响着eNOS转录和翻译。电针运用比较广泛的一种“非药物”治疗手段，我们团队前期实验已经证实电针能提高Akt磷酸化和eNOS表达，促进局灶脑缺血梗死区周围血管再生。研究显示腹腔注射Tβ4后使脑卒中大鼠大脑皮质梗死区域周边血管密度增加，但其机制尚不清楚。体外研究证实Tβ4能通过PI3K/Akt/eNOS通路，促进内皮祖细胞转移和脉管形成。本实验重点研究电针刺激局灶脑缺血/再灌注大鼠后，Tβ4的表达是否会受到影响，以及其下游的PI3K/Akt/eNOS通路是否会影响。腹腔注射Tβ4多肽是否也能促进局灶脑缺血/再灌注损伤大鼠大脑皮质血管再生和神经功能康复。目的探索电针对局灶脑缺/血再灌注损伤后大鼠大脑皮质内源性Tβ4多肽表达的影响，观察电针作用于局灶脑缺血/再灌注损伤大鼠“百会”穴和“四关”穴后促进血管再生的机制及其靶点。同时给SD大鼠腹腔注射外源性Tβ4多肽，观察其对局灶脑缺血/再灌注损伤大鼠大脑皮质血管再生的影响，以LY294002为干预手段，探索其对血管再生影响的机制。方法1.将雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠随机分为假手术组（S组）、模型组（IR组）、电针组（EA组）。采用线栓法制备大脑中动脉缺血/再灌注模型（MCAO/R模型）。IR组和EA组分为再灌注1d、2d、3d、7d4个亚组。电针刺激针刺“百会”穴（GV20）及体穴“四关”穴（“合谷”穴LI4+“太冲”穴LR3），频率选用2/20HZ，20min，电流强度为1mA，每天一次，最长连续使用7d。通过HE染色观察局灶脑缺血后病理变化。逆转录聚合酶链反应法（reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR）检测S组、IR组和EA组大鼠大脑皮质Tβ4和eNOSmRNA表达，免疫组化检测S组、IR组和EA组各时间点大鼠大脑皮质Tβ4、eNOS表达和CD31阳性的血管，并对CD31阳性的微血管进行计数，计数血管密度（血管均值/视野面积）。Western blot检测S组、IR组和EA组大鼠大脑皮质Akt磷酸化水平。采用Longe5分法对IR组和EA组各个时间点大鼠进行神经功能学评分了解局灶脑缺血/再灌注后大鼠神经功能缺损情况。2.将SD大鼠随机分为假手术组（S组）、模型组（IR组）、Tβ4组（IRT组）、Tβ4+LY294002组（IRTL组）、0.9%氯化钠注射液组（IRN组），缺血2h后把IR、IRN和IRT组分为3d和7d两亚组。采用线栓法制备大脑中动脉缺血/再灌注模型（MCAO/R模型）。Western blot检测大脑皮质Akt磷酸化水平和eNOS蛋白表达；免疫组化检测大脑皮质Tβ4和CD31蛋白表达；荧光定量PCR检测大脑皮质eNOS、SDF-1及CXCR4mRNA表达；Longa法对神经症状学评分。结果1.1RT-PCR结果与S组比较，IR组第1d大脑皮质缺血半暗带Tβ4mRNA表达增多，第2d表达高峰，第3d降低（P<0.01）；与IR组相比，EA组第1d、EA组2d Tβ4mRNA表达无显著变化，EA组第3d显著增高，与EA组第3d相比，EA组第7d Tβ4mRNA降低，但还显著高于IR组（P<0.05）。与S组比较，IR组第1d大脑皮质缺血半暗带eNOS mRNA表达在第1d时显著升高(P <0.01)，第3d达高峰，第7d下降（P<0.01）；与IR组比较，电针能显著增加eNOS表达，第3d和第7d比较显著（P<0.01）。1.2Western blot定量分析结果与S组比较，局灶脑缺血/再灌注损伤后Akt磷酸化水平显著升高，第3d最高，第7d降低（P<0.01）；与IR组比较，电针刺激“百会”穴和“四关”穴后能显著增加Akt的磷酸化水平，EA1d Akt磷酸化水平升高，EA3d达高峰，EA7d下降（P<0.01）。1.3免疫组化结果1.3.1Tβ4蛋白表达半定量分析免疫组化结果显示S组大脑皮质、海马、脑室旁周围、内囊等处脑组织有着色较浅的Tβ4表达阳性的细胞，Tβ4主要分布在细胞质中。IR组中大脑皮质、海马、脑室旁周围、内囊等处脑组织有着色较深的黄褐色Tβ4阳性细胞，与S组比较，Tβ4阳性细胞在梗死中心和边缘都有增加，边缘增加较显著（P<0.01），形态学上可以判断Tβ4在梗死中心区主要表达在胶质细胞，在缺血半暗带主要表达在神经细胞。EA组Tβ4表达规律与IR组相似，但表达的量显著升高。与S组比较，IR组第1d大脑皮质缺血半暗带Tβ4蛋白表达显著增多，第2d达高峰，第3d下降（P<0.01）；与IR组相比，电针对局灶脑缺血/再灌注第1d、2d Tβ4蛋白表达影响不大，EA1d、EA2d Tβ4蛋白表达无显著变化（P>0.05），EA3d显著增高，与EA3d相比EA7d Tβ4蛋白表达降低，但还显著高于IR组（P<0.05）。1.3.2eNOS蛋白表达半定量分析免疫组化结果显示S组有少量的eNOS表达，从形态学上初步判断eNOS蛋白可能表达在在神经细胞，血管内皮细胞，胶质细胞等。而IR组缺血侧大脑皮质、海马、脑室旁周围等处脑组织、血管周围可见着色较深的eNOS表达阳性的黄褐色细胞。EA组表达规律与IR组相似，但eNOs表达阳性的黄褐色细胞数量显著增多（P<0.05）。与S组比较，IR组第1d大脑皮质缺血半暗带eNOS蛋白表达在第1d显著升高，第3d达高峰，第7d下降（P<0.01）；与IR组比较，EA组eNOS蛋白表达增多在第3d和7d最显著（P<0.01）。1.3.3微血管计数免疫组化结果显示S组整个脑组织切片都有着色较浅的CD31表达阳性的血管，但血管直径较大，微血管数目较少。CD31阳性的血管形态呈点、圈、条索状分布。IR组CD31阳性的血管形态呈点、圈、条索状的血管密度显著增加，主要分布在梗死灶周围。EA组CD31阳性微血管分布规律与IR组相似，但EA组CD31阳性微血管密度显著增多。与S组比较，IR组标记的阳性血管呈点、圈、条索状分布，CD31标记阳性的血管密度在缺血再灌注后第3d开始显著增多，第7d最显著（P<0.05）；与IR组比较，电针刺激“百会”穴和“四关”穴后大脑皮质缺血半暗带血管分布还是呈点、圈、条索状分布，但密度显著增加，电针7d CD31阳性微血管密度比IR组显著增多（P<0.05）。1.4HE染色结果分析S组基本看不到坏死的红色神经元，但是IR组和EA组可见大量的成团状分布的坏死神经元。S组可见少量的炎性细胞，IR和EA组可见大量的炎症细胞，在梗死灶周围尤其是有大量红色神经元分布的地方大量分布。HE染色结果显示局灶脑缺血/再灌注损伤后梗死中心及缺血半暗带有大量的坏死神经元及炎性细胞分布。与IR组比较，EA组坏死神经元计数显著低于IR组，炎性细胞计数也显著低于IR组，范围局限。1.5神经功能评分神经功能评分显示电针能显著促进局灶脑缺/血再灌注大鼠神经功能的恢复。再灌注2h后与再灌注1d、2d、3d、7d比较，神经功能缺损评分时逐步降低，与IR组比较，EA1d、EA2d、EA3d神经功能改善并不显著（P>0.05），但是EA7d神经功能改善最显著（P<0.05）。2.1Q-PCR结果与IRN比较，IRT3d eNOS mRNA表达显著升高，第7d降低（P<0.05）；SDF-1、CXCR4和eNOS mRNA有着平行变化的趋势，IRT3d增多，7d降低（P<0.05）。2.2Western blot结果2.2.1Akt磷酸化水平Wester blot结果显示S组有较少的p-Akt表达。IRN组Akt磷酸化水平显著高于S组。与S组比较，IRN3d显著增多，IRN7d增多最显著（P<0.05）。与IRN组相比，IRT3d Akt磷酸化水平显著提高，第7d下降，但还保持在较高水平（P<0.05）；但阻断PI3K/Akt通路后，在IRTL组，Akt磷酸化水平显著减少（P<0.01）。2.2.2eNOS表达p-Akt下游蛋白eNOS与p-Akt表达有着同样的变化趋势。与IRN组比较，IRT3d显著增多（P<0.01）；与IRT组相比，IRTL3d和7d p-Akt和eNOS表达显著减少（P<0.01）。2.3免疫组化结果2.3.1Tβ4在大脑皮质的表达S组可以见到少量的Tβ4表达，主要分布在海马周围。IR组可见坏死区域有大量的Tβ4表达，主要分布在胶质细胞和神经元。IRT组3d，大脑皮质，海马，基底节等区域都能看见大量的Tβ4表达，梗死区域最多，主要分布在胶质细胞和神经元，IRT组7d，Tβ4表达显著增加，显著高于IR组和IRT3d（P<0.05）。2.3.2CD31标记新生血管密度S组有少量的新生血管。IR组新生血管密度显著增加。与IR3d比较，IR7d血管密度显著大于IR3d的血管密度（P<0.05）。与IRN组相比，IRT3d CD31阳性微血管密度增加，第7d增加更加明显(P<0.05)；使用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，新生血管的密度显著减少（P<0.01）。2.3.3HE染色结果S组HE染色未见明显缺血缺氧病灶。IR组7d比3d梗死灶明显，IR3d梗死灶周围细胞排列紊乱，有大量的炎症细胞浸润，梗死灶中心和周围还分布着红色坏死神经元。IR7d细胞排列更加紊乱，大量的炎症细胞核红色坏死神经元分布在梗死灶中心和周围。IRN组HE染色无IR组无显著差异（P>0.05）。与IR组相比较，IRT组坏死程度比IR组轻，红色神经元计数也显著比IR组少（P<0.05）。与IRT组比较，IRTL组坏死程度较重，炎症细胞大量浸润，红色神经元计数显著增多（P<0.05）。2.5神经功能症状学评分与IR组比较，IRT组神经症状学评分在再灌注后3d没有显著区别，但第7d神经功能改善显著（P<0.05）；与IRTL组比较，IRT组神经功能恢复较好（P<0.05）。结论（1）电针可能通过促进局灶脑缺血大鼠大脑皮质内源性Tβ4表达，促进下游的PI3K/Akt/eNOS通路变化，从而促进局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质梗死灶周围血管再生和神经功能康复。（2）给局灶脑缺血再灌注大鼠腹腔注射外源性Tβ4多肽后，其可能通过PI3K/Akt/eNOS通路促进大鼠大脑皮质梗死灶周围血管再生和神经功能康复。