论文部分内容阅读
第一部分Tim-3基因多态性与湖北汉族人群AML相关性研究目的：研究Tim-3基因启动子区-1516、-574及编码区3的+4259SNP位点与湖北汉族人群AML相关性及连锁不平衡关系,探讨可能存在的疾病相关单体型。方法：用等位基因PCR扩增方法(AS-PCR)对湖北汉族人群AML200例及健康对照组173例的Tim-3基因启动子区-1516、-574及编码区3的+4259SNP位点进行分析,H-W检验频率分布的遗传特性,计算基因频率,等位基因频率,并用统计软件SHEsis进行LD连锁不平衡分析和单体型Haplotype分析。结果：2个基因Tim-3SNP位点-1516和4259位点基因频率分布满足遗传特性,而-574位点基因具有突变杂合子聚集趋势；Tim-3-1516G>T等位基因G在AML患者中频率为75.5%,对照组中为82.4%, P<0.05; Tim-3-574T>G等位基因G频率在AML中77.5%,对照组中为80.1%, P>0.05; Tim-34259G>T等位基因T基因频率在AML中为98.5%,对照组99.1%,P>0.05；连锁不平衡分析,-574位点与4259位点,D’值为0.49,r2为0.011；单体型分析Hap1GGT P值0.029,ODD比值0.714；Hap2GTT P值0.763,ODD比值1.064；Hap3TGT P值为0.034,ODD比值1.554;Hap4TTT P值为0.453,ODD比值1.273。结论：-1516位点可能为AML存在的易感SNP位点。而-574与4259具有较强的紧密连锁,Hapl单体型GGT和Hap3单体型TGT分别可能为AML的保护型和危险型单体型。此次研究,提供了3个湖北汉族人群Tim-3与AML疾病多态性的SNP数据,为进一步研究Tim-3的单体型及AML基因诊断与药物靶向治疗提供了依据。第二部分Tim-3及相关分子湖北汉族人群AMLPBMC中的mRNA水平的表达分析目的：研究Tim-3(T cell immunoglobulin mucin-3)及相关分子PD-1、Lag-3、 Galectin-9在湖北汉族人群急性髓系白血病(AML)外周血单个核细胞PBMC中的mRNA水平的表达分析方法：采用逆转录和实时定量PCR方法对湖北地区47例AML患者和40例健康对照者外周血单个核细胞中Tim-3及相关分子PD-1、Lag-3、Galectin-9的mRNA进行检测,应用软件SPSS19.0进行统计分析,GraphPad Prism5进行绘图显示。结论：①Tim-3、PD-1、Lag-3、Gal-9mRNA在AML患者与健康对照组PBMC中,结果比较无统计学差异；②Lag-3、Gal-9在初诊组与缓解组的比较中,P<0.05,存在显著性差异,缓解组水平较高于初诊组；③不含M3的AML病例组,与健康对照组,P>0.05,无统计学差异。④M2与M3的对比中,仅Lag-3组存在统计学差异,Tim-3组P值为0.0539,接近于0.05.⑤性别对PD-1和Gal-9有影响。男性患者PD-1与Gal-9组较低于对照组,女性则显示Lag-3mRNA在AML中下调。第三部分Tim-3启动子区-574位点荧光素酶报告基因的构建与鉴定目的：构建Tim-3启动子区包含-574SNP位点在内的荧光素酶报告基因,为Tim-3分子在AML疾病的发病机制和免疫调控研究提供基础。方法：设计Tim-3启动子区包含-574位点的特异性引物,克隆基因全长594bp,连入T载体,并转化大肠杆菌E.co.li.,氨苄青霉素Amp筛选,克隆阳性白色菌落,提取质粒并用Hind III和Kpn I双酶切验证,正确的阳性克隆与具有同样双酶切位点的pGL-3-amp-luc报告基因载体连接,再次转化,质粒扩增,酶切和测序鉴定。结果：以白血病患者140号样本-574SNP位点GG型为模板,与pGL-3-neo-luc转化,克隆增殖后,经Hind III和Kpn I双酶切及测序鉴定,成功构建了Tim-3启动子区含-574位点在内的目的基因片段。结论：成功构建了含Tim-3启动子区-574位点GG基因型的荧光素酶报告基因,为研究Tim-3基因的调控机制和在AML疾病中的发病机制奠定前期基础。