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Orexins(又称 hypocretin)是下丘脑神经肽,包括 orexin-A 和 orexin-B。Orexins受体有OX1和OX2两种亚型,属于G蛋白耦联受体。Orexin-A可与OX1受体及OX2受体结合且具有相似的亲和力,而orexin-B与OX2受体的亲和力远高于OX1。脑内orexin能神经元胞体集中分布在下丘脑外侧区和穹窿周围区,发出上行和下行纤维,参与调控觉醒和睡眠、能量代谢、摄食、神经内分泌和运动等多种功能活动。海马作为脑内边缘系统的主要组成部分,在学习、记忆及认知等高级神经活动中发挥重要作用。根据细胞形态及神经纤维通路的不同,海马又分为CA1、CA2、CA3和CA4等区域。形态学研究表明,海马接受下丘脑发出的orexin能纤维支配,并表达高水平的orexin受体。其中海马CA1和CA2区主要表达OX1受体,而CA3区主要表达OX2受体。早期行为学研究揭示,侧脑室注射orexin-A调节大鼠学习和记忆,阻断海马CA1区OX1受体可降低大鼠空间学习和记忆能力。然而,迄今为止,关于orexin对海马不同区域神经元自发放电的直接效应及其受体机制尚不十分清楚。目的:探讨orexin-A对海马CA1区神经元自发放电频率及模式的影响及其受体机制。方法:本实验采用多管微电极压力给药、在体细胞外单细胞放电记录、免疫组织化学等实验方法。雄性Wistar大鼠麻醉后固定于Narishige脑立体定位仪,根据脑图谱于海马CA1区(前囟后3.0-3.8 mm,旁开2.0-2.4 mm)行开颅手术。三管玻璃微电极尖端直径3-10 μm,电阻10-20 MΩ,其中的记录电极加入含2%滂胺天蓝的0.5 M的乙酸钠溶液,其余两管分别加入不同的药物。记录的电信号经MEZ-8201放大器放大,由Spike2电生理数据分析软件分析单个神经元自发放电的频率和放电间隔的变异系数(coefficient of variation,CV)。采用成对t检验分析加药前后同一神经元自发放电频率和模式的变化,曼-惠特尼秩和检验用于比较两组间的差异,卡方检验用于比较不同放电模式与orexin反应神经元的相关性。结果:1.在大鼠海马CA1区记录的23个神经元中,微压力注射orexin-A(0.01mM)可使其中15个神经元的自发放电频率由 2.96±0.85 Hz 增加至 8.45±1.86 Hz(t=4.87,n=15,P<0.001)。Orexin-A平均增加放电频率411.78±125.46%,较生理盐水对照组(加药前:2.71±0.86Hz,生理盐水:2.55±0.87Hz;t=0.56,n=8,P=0.591)明显增强(Z=3.87,P<0.001)。Orexin-A对CA1区神经元的CV无明显影响(加药前:1.23±0.09,orexin-A:1.36±0.11;t=1.20,n=15,P=0.250)。2.在海马 CA1 区记录的 17 个神经元中,单独给予特异性OX1受体阻断剂SB-334867(0.1μM)可使其中7个神经元的放电频率由4.02±1.08Hz降至2.11±0.58Hz(t=2.68,n=7,P=0.036),表明内源性orexin调节海马CA1区神经元自发放电。而在另外10个神经元,给予特异性OX2受体阻断剂TCS-OX2-29(0.1μM)后其放电频率无明显改变(加药前:3.11±0.64Hz,TCS-OX2-29:3.07±0.71Hz;t=0.11,n=10,P=0.918);3.同时给予orexin-A及SB-334867可完全阻断orexin-A对CA1区神经元的兴奋效应。在9个CA1区神经元,同时加药使其放电频率由3.13±0.90 Hz变为3.08±0.79 Hz(t=0.09,n=9,P=0.928);4.应用 PLC 抑制剂 U73122 可完全阻断由 orexin-A所致的CA1区神经元的兴奋效应。在记录的8个orexin-A敏感神经元,加入U73122后再加入orexin-A可使放电频率由3.11±0.48 Hz改变至3.33±0.66 Hz(t=0.94,n=8,P=0.376),表明OX1受体通过PLC通路发挥其对海马CA1区神经元的兴奋效应;5.免疫组织化学染色结果表明,电生理实验记录大鼠的下丘脑外侧区表达orexin-A阳性神经元,而海马CA1区可见清晰的orexin-A阳性纤维支配。进一步免疫荧光双标记技术显示海马CA1区表达OX1受体,且OX1受体既表达在PV阴性海马神经元也表达在PV阳性的中间神经元。结论:本研究结果证实orexin-A通过OX1受体增加大鼠海马CA1区神经元的自发放电频率。内源性orexin通过OX1受体调控CA1区神经元自发放电。PLC信号通路参与激活OX1受体所致的CA1区神经元的兴奋效应。本实验结果为进一步探讨orexin在学习记忆中的作用及其与阿尔茨海默病的相关性提供了一定的理论和实验依据。