转基因技术是20 世纪80 年代发展起来的一项重要技术,通过向受精卵或早期胚胎中导入外源DNA,能有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰和改造,进而培养新的品系。鱼类转基因研究的一个重要方向就是定向育种,即通过转基因改良生产性状,如快速生长、抗病虫害、抗冻、抗盐碱等。草鱼(Grass carp ,Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要品种之一,引起草鱼出血病的草鱼出血病病毒(Grass carp reovirus virus,GCRV)流行广、危害大、发病季节长,死亡率高达90%以上,严重阻碍了我国淡水养殖业的发展。目前对该病毒还没有有效防治的药物或方法,因而进行抗草鱼出血病病毒育种研究对淡水渔业的发展具有重要意义。由小的干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的RNA 干扰(RNA interference,RNAi ) 是近年来快速发展的一种转录后基因沉默(post-transcrptional gene silencing,PTGS)方法。它是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的干扰RNA 导入细胞后,使该mRNA 发生特异性的降解,从而导致该基因的表达沉默。而且,利用H1-RNA 基因的启动子构建RNA 干扰载体,将这种载体导入到体内,可以长期稳定的表达小干扰RNA,使靶基因表达沉默。RNA 干扰现象是生物防范病毒或转座子诱导DNA 突变的一种防御机制,目前正在利用这一机制发展一种重要的基因治疗手段。基于以上认识,本研究将利用RNAi 技术,以草鱼出血病病毒为模型,结合转基因技术,对RNA 干扰在鱼类抗病毒病中的分子机理和应用前景展开探索性研究,以期为获得鱼类抗病新品系打下基础。另外,该模型的建立也将为鱼类基因功能和信号转导研究提供有效的手段。本论文主要进行了如下几个方面的研究: (1) H1 基因及其启动子的克隆:基于已知的人、鼠、斑马鱼等H1 基因序列,利用同源克隆法,设计简并引物,以草鱼基因组DNA 为模板进行PCR 扩增,克隆得到草鱼H1 基因301bp。随后根据克隆的H1 基因序列,设计特异引物,用TAIL-PCR 法克隆,得到H1 基因启动子738bp。(2) H1 启动子活性分析:为了筛选合适的启动子区段用于构建表达siRNA的载体,需对H1 启动子进行详细的活性分析。设计引物扩增三段不同长度的启