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研究背景2014年广东省爆发了1型登革热疫情,2015年出现了2型登革病毒(DENV2)流行。2016年,随着寨卡病毒(ZIKV)在美洲地区爆发流行,中国也发现了输入性病例。目前认为ADE效应是重症登革发生的重要风险因素,但DENV或ZIKV感染后宿主的免疫状况仍不清。登革病毒共有四种血清型(DENV1-4),同一血清型因病毒株序列的差异又可被分为不同的基因型。我们的前期研究发现2014年爆发的登革热疫情中有两种不同的基因型同时流行,不同的基因型间是否存在血清抗体的交叉反应?新发的ZIKV感染常与DENV出现在同一地区。ZIKV在序列和结构上与DENV有高度同源性,其中DEVN2 E蛋白序列与ZIKV一致性高达54%,这种高度同源性可引起免疫学上的交叉反应。研究内容及目的本文首先探讨DENV1血清型不同基因型感染机体后血清抗体的产生,揭示登革热同一血清型不同基因型间血清抗体交叉反应的变化;并进一步以2015年潮州地区DENV2病人及本院收治的ZIKA病人为研究对象,分析登革热和寨卡病毒诱导宿主抗体产生及交叉反应的特征。研究方法1.DENV1,2型及ZIKV重组E蛋白质粒的构建及蛋白表达C端带标签的DENV1(GenotypeⅣ和GenotypeⅠ)、DENV2和ZIKA重组E蛋白的表达采用哺乳动物细胞表达体系。从病人急性期血清提取病毒RNA,用RT-PCR法或两步PCR法扩增病毒E蛋白膜外区,克隆到质粒pc DNA 3.1构建表达质粒。经序列验证的质粒转染293T细胞,收获含重组E蛋白的细胞上清,直接进行下一步捕获ELISA。2.捕获ELISA的建立用抗标签的抗体捕获293T细胞转染上清中的E蛋白,建立捕获ELISA法。3.血清抗体与重组病毒E蛋白结合分析1)用建立的ELISA法检测36例DENV1感染者病程不同时期血清与GenotypeⅣ、GenotypeⅠE蛋白的结合反应,血清样品以1:1000稀释开始,10倍系列稀释,共5个稀释度。2)30例DENV2感染者和3例ZIKV感染者血清抗体分别与ZIKV,DENV1和DENV2E蛋白结合反应。血清样品以1:100稀释开始,3倍系列稀释,共8个稀释度。研究结果1.成功构建ZIKV,DENV1和DENV2重组E蛋白表达质粒,并经序列验证,表达蛋白大小约56KD。以表达的E蛋白建立了可用于血清抗体检测的捕获ELISA法。2.在检测的36例DENV1型病例中,病程不同时期的血清与GenotypeⅣ和GenotypeⅠE蛋白均有明显的结合反应,在病程后期血清表现更强的抗体结合反应(P=0.038)3.在检测的30例DENV2型住院病例中,大部分病例(24/30)血清与DENV1和ZIKV E蛋白有明显的结合反应,表现为3种不同的结合形式,DENV1>ZIKA(4/30),DENV1<ZIKA(11/30)和DENV=ZIKA(9/30)。在检测的3例ZIKV血清中,有两例在急性期及恢复期均呈很强的抗体反应,且与DENV1和DENV2有明显交叉。结论1.成功在哺乳动物细胞体系表达重组E蛋白,并建立了可用于血清抗体检测的捕获ELISA法。2.DENV1血清型不同基因型间均有抗体交叉结合反应,且随病程结合反应有增加的趋势。3.DENV和ZIKV均可诱导宿主血清抗体的产生,且呈高度的交叉反应特征。