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全球每年100万以上的妇女被诊断患有乳腺癌,占妇女癌症的25%。乳腺癌的常规治疗除了传统的手术、放疗、化疗和内分泌辅助治疗外,利用中药进行综合调节治疗也是近年来研究的热点领域。中药治疗能够有效地减轻患者的临床症状,提高他们的生存质量,并防止肿瘤细胞的复发转移,同时还可以与放化疗配合增效减毒。因此从天然产物中寻找抗肿瘤化合物已经成为抗肿瘤药物研发的重要方向。龙血竭(Draconis Sanguis)是活血化瘀的名贵树脂类药材,具有活血化瘀、祛腐生肌、止血收敛、消肿止疼作用,被誉为“活血之圣药”。近来的研究表明,龙血竭具有细胞毒性和抗肿瘤活性,可通过激活细胞凋亡信号通路,诱导肿瘤细胞凋亡。龙血素A是从龙血竭中提取的一种黄酮类化合物,其分子式为4-羟基-2,6-二甲氧基二氢查尔酮,它在龙血竭中含量丰富。目前,关于龙血素A的抗癌活性研究甚少。鉴于此,本课题拟通过观察龙血素A对人乳腺癌MCF-7细胞增殖凋亡及ER蛋白表达的影响及其可能机制,以期发现具有高活性、低毒副作用、抗耐药等性质的抗肿瘤新药。本研究将龙血竭的活性物质龙血素A(Loureirin A),作用于雌激素受体阳性的人乳腺癌MCF-7细胞株,观察龙血素A对人乳腺癌MCF-7细胞增殖凋亡及ER蛋白表达的影响及其可能的作用机制,实验内容包括:(1)体外培养MCF-7细胞,用不同浓度(15,30,45,60,75,90,105,120μmol/L)的龙血素A作用细胞24h、48h、72h后,应用MTT比色法评估该药物对MCF-7细胞生长抑制作用,并计算IC50。(2)通过MTT法检测龙血素A对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用的影响,通过检测细胞增殖标志性蛋白Ki67的表达,观察龙血素A对MCF-7细胞的增殖作用的影响。(3)通过检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-XL/S的表达,探讨龙血素A是否在体外诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡及其可能的机制。(4)检测龙血素A干预的乳腺癌细胞中erα和erβ的表达情况,探讨龙血素a对er蛋白表达的影响。方法:测定龙血素a对mcf-7细胞的生长作用并计算ic50。用不同浓度(15,30,45,60,75,90,105,120μmol/l)的龙血素a作用于体外培养的mcf-7细胞,作用时间分别为24h、48h、72h后,应用mtt比色法评估该药物的细胞生长抑制作用,计算细胞抑制率,并计算ic50,选取龙血素a最佳实验浓度。1.龙血素a作用于mcf-7细胞的体外实验用龙血素a作用于人乳腺癌mcf-7细胞,通过mtt法进行生长曲线的测定,免疫荧光分析方法检测细胞增殖标志性蛋白ki67,观察龙血素a对mcf-7细胞的增殖作用的影响;通过hoechst33258法、流式细胞术法检测龙血素a对mcf-7细胞凋亡的影响;免疫荧光、免疫组化、免疫印迹分析法检测龙血素a对凋亡调节因子caspase3、bax、bcl-xl/s蛋白表达的影响。结果:2.龙血素a对mcf-7细胞的生长作用的影响(1)mtt法检测,龙血素a对mcf-7细胞生长有抑制作用,并在一定范围内有量效和时效关系,数据分析得出龙血素a作用mcf-7细胞的生长半数抑制浓度(ic50)值为53.13μmol/l,取60μmol/l为最佳实验浓度。(2)免疫荧光法检测细胞增殖性标志蛋白ki67的表达,用药组ki67的表达强度明显低于对照组。3.龙血素a对mcf-7细胞凋亡的影响hoechst33258染色根据活细胞弱蓝色荧光,核圆形,偶可看到较深的蓝色颗粒,凋亡细胞呈亮蓝色荧光,核分叶或碎片状来分析各组细胞的凋亡情况,各组的凋亡率分别为:用药组龙血素a作用48h为39.47%(15/38),72h为52.30%(23/44);对照组48h为10.07%(14/139),72h为15.41%(45/292),各组间的差异有统计学意义,且存在时间依赖关系。4.龙血素a对凋亡调节因子caspase3、bax、bcl-xl/s的影响(1)bax主要表达于细胞胞质、胞膜或核膜,阳性反应呈棕黄色。对比两组,用药组的荧光强度明显强于对照组。(2)免疫组织化学染色结果,caspase3主要表达于胞质和胞核中,阳性反应呈棕黄色。对比两组,用药组的平均光密度值(0.368±0.682)明显强于对照组(0.218±0.326,p<0.05vs用药组);Bax主要定位于细胞胞质、胞膜或核膜,阳性反应呈棕黄色;对比两组,用药组的平均光密度值(0.411±0.295)明显强于对照组(0.255±0.490,p<0.05 vs用药组)。蛋白印迹法检测Bax、Bcl-XL/S的表达结果,用药组Bax的相对表达量明显高于对照组(p<0.05),而Bcl-XL/S相对表达量明显低于对照组(p<0.05)。(3)流式检测仪检测结果显示,用药组乳腺癌细胞72h的细胞凋亡率为34.6%,对照组凋亡率为7.23%,两者有显著性差异(P<0.05)。4.龙血素A对雌激素受体ERα和ERβ的影响免疫荧光染色结果,ERα表达于胞质和胞核或胞膜。对比两组,用药组ERα表达荧光强度明显弱于对照组;ERβ主要表达于胞核和胞质,对比两组,用药组的荧光强度明显强于对照组。蛋白印迹法检测ERα和ERβ的表达结果,用药组ERα的相对表达量明显低于对照组(p<0.05),而ERβ的相对表达量明显高于于对照组(p<0.05)。结论:1.龙血素A对ER阳性的人乳腺癌MCF-7细胞的生长有抑制作用,其生长抑制是通过干扰细胞增殖活性,诱导肿瘤细胞凋亡。2.龙血素A可能通过上调caspase-3激活Bax/Bcl-xl线粒体信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡。3.龙血素A可能是通过上调ERβ和下调ERα的表达,降低细胞内ERα/ERβ的表达比例,使S期DNA合成减少,抑制细胞增殖速度来抑制肿瘤细胞的生长分化,其具体的调控机制尚不清楚,需要进一步的研究和探索。