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由Xanthomonas oryzae pv．oryzae引起的白叶枯病严重危害水稻，可是国内一直集中利用Xa3和Xa4两个抗性基因，因而利用新的抗性基因改良现有品种的抗性日趋重要。 云南地方粳稻扎昌龙（Zhachanglong，ZCL）对分别来自中国、菲律宾和日本的12个水稻白叶枯病菌表现抗性，对PXO61表现出的成株期抗性受Xa22（t）控制。已从明恢63中克隆的Xa26与Xa3可能是相同的基因，ZCL中含有Xa26相同的基因。 （1） 目标基因Xa22（t）的精细定位 构建了7680个单株的由珍珠矮和扎昌龙配制的F2群体，用两个SSR标记RM144和RM224筛选PXO61接种后的极端感病单株得到29个极端感病重组单株，目标基因Xa22（t）与RM144和RM224分别有20个和9个极端感病重组。利用这些重组单株分析Xa22（t）区域的标记，将Xa22（t）定位在明恢63-BAC克隆M3H8的亚克隆3／7A10和R1506之间，和这两个标记分别有2个和1个重组，同时得到三个共分离的标记M3H8-1、Sub11和X4-88。由于3／7A10是M3H8的亚克隆，并且R1506能和M3H8杂交，因而Xa22（t）定位在M3H8上。 利用Xa26的序列检索得到日本晴序列克隆AC116367，分析这个克隆发现抗病基因有关的序列信息很丰富，而且AC116367在目标基因Xa22（t）区域，因而将AC116367作为目标基因Xa22（t）的电子定位克隆。 （2） 确定候选基因及验证功能 对M3H8的两个片段的序列进行酶切位点分析，Spel可以将包含Xa26的19-kb片段切下来，NheI可以将8-kb的LRR片段切下来,AccI酶切片段可以覆盖12-kb的LRR-Kinase。于是根据M3H8的序列，采用等位酶切法回收ZCL对应大小的片段区域，克隆到合适载体上用特异引物筛选，再将得到的阳性克隆的外源片段转接到pCAMBIA1301，最后转化到感病品种台北309中来验证功能。 转化ZCL中含有Xa26．的19-kb片段得到10株抗性植株，证明了ZCL中的Xa26有功能。对于包含NBS结构的80112-2、LRR结构的8-kb片段和LRR-Kinase结构的12-kb片段的转化验证，每个片段的转基因植株数量都在100株左右。 得到一个ZCL-BAC克隆80112，其12-kb片段与R1506杂交，而且具有NBS结构。定位克隆M3H8也有NBS结构，且NBS在ZCL中表达，于是将12-kb的包含NBS结构的片段转化到台北309中，得到1株抗性植株，说明ZCL中具NBS结构的基因可能有功能。 （3） Xa22（t）区域相关片段的RT-PCR表达分析 对于Xa26内的两对引物RkbLZR和Rkb469一2145，在三个抗病材料zCI林政22（t）)、waso Aikoku3(从孕。，携带Xa匀和IRBB4(xa为中组成型表达，而在ZZA中没有表达，这可能与Xa26表现的抗病功能有关。 利用一个激酶结构RKORFI内的几对引物作RT-PCR表达分析，RKORFI在ZCL、WA3和IRBB4中组成型表达，在ZCL和WA3中的表达相同，而在ZCL与IRBB4中的表达有差异，Xa22（t）区域可能具有激酶结构的基因zCL祝K。 NBS在ZCL和IRBB4中组成型表达，而在WA3中没有表达，说明NBS.LRR与Xa3（可能为受体激酶结构）无关。由电子定位克隆日本晴的ACll6367越过约500一kb的转座子富集区后，NBS.LRR结构的保守序列很多，而且M3HS也扩增出NBS结构，Xa22（t）区域可能有NBS-LRR结构的基因zCL价旧S。RT-PCR表达分析表明Xa22（t）区域有Xa26、zCL.RK和ZCL小旧S等不同结构的基因;结合几个白叶枯病抗性基因在Xa22（t）区域的定位结果，zCL中的Xa22（t）与Xa4和XaZ‘紧密连锁，Xa22（t）与Xa4连锁更紧密。 （4）目标基因区域进化 许多抗性有关的基因在目标基因区域紧密连锁，Xa22（t）区域进化有亚麻抗锈病基因L模式，其中的一个基因XaZ石在IRBB3、明恢63、日本晴（Nipponbare，Nip）和9311中都有等位基因。Xa22（t）区域的进化也有亚麻抗锈病基因M模式，明恢63中在XaZ石的附近还有3个家族成员（Sun etal.，2004），日本晴中在XaZ石的等位基因NIPS一26H附近也有8个同源的受体激酶结构。聚类分析xa22（t）区域的抗病基因同源序列表明，paralogs的同源性较低，而orthologS间的同源性相对较高，进化采用Birth一and一Death模式。 对目标基因Xa22（t）的克隆，可以开发更好用的PCR标记作分子标记辅助选择育种，更好地研究ZCL的广谱抗病特性，探索目标基因区域的进化机制。