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本论文研究工作的内容涉及化学学科的分析化学、化学生物学和临床医学学科的肿瘤学,是属于交叉学科的研究。研究的手段主要是通过比较蛋白质组学和系统生物学的分析技术和手段,揭示肝癌细胞侵袭转移的分子机制。本论文工作的主要贡献是(1)发现炎症通路和抗凋亡通路在肝癌细胞转移过程中起了非常重要的作用；(2)在肝癌细胞系中共鉴定出7,034种非冗余的蛋白质,系统生物学研究中与转录组数据进行了初步对接,揭示TPAE值的高低与蛋白质的亚细胞定位有紧密联系(TPAE,转录本到蛋白质的放大效率)；(3)分泌蛋白质组检测出低丰度的SDC4和ANGPTL4,发现转移相关的重要膜蛋白MET也可以通过水解作用分泌到细胞外,并发现HSPA5在高低转移细胞系中发生了显著的亚细胞定位变化；(4)对转移性肝癌细胞的O型糖基化修饰和降解作用进行了初步研究,发现部分溶酶体和细胞膜的蛋白质通过降解作用获得活性；(5)在方法学方面,证明2DE、DIGE、iTRAQ、ID SDS-PAGE-RPLC-LTQ Obitrap等技术在肝癌机制研究中的独特作用；在分泌蛋白质组研究中发展了新方法,有效抵消了细胞碎片等对结果的干扰；发展了磁性材料富集色氨酸肽段的新技术。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国和亚非地区常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率在恶性肿瘤中排第三位。而肝癌的转移和复发是影响其远期疗效的重要因素。因此,阐明肝癌转移复发的分子机制,寻求特异性早期诊断标志物分子,对提高HCC患者生存率、改善生活质量均具有重要意义。本研究课题以遗传背景相似而转移潜能不同的人肝癌细胞系为模型,利用多种蛋白质组学技术和生物信息学工具,在蛋白质差异表达、系统生物学、亚细胞定位和翻译后修饰作用等方面对肝癌的转移机制进行了研究。论文分六个部分进行论述：第一部分：前言。这一章重点概述了蛋白质组学领域的技术发展情况,并针对其在肝癌转移机制和靶标蛋白质的研究进展方面进行了综述。比较了现在蛋白质组学常用的定量方法,并对其各自的优势和局限性进行了讨论。同时,本章论述了亚细胞蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学、系统生物学和生物信息学等在技术发展和生物应用等方面的进展。此外,对本论文研究中的转移性肝癌细胞模型的建模过程和转移能力也进行了简述。第二部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的比较蛋白质组学研究。本部分中首次对四个不同转移潜能的人肝癌细胞系进行系统的研究,代替传统的单基因生物解读方法,利用生物信息学技术在生物通路和蛋白质相互作用网络的水平上进行研究,发现与炎症和抗凋亡相关的NFκB通路被激活,并发现与肝癌转移能力正相关表达的HDGF、hsp27、HPGD矛(?)STMN1等分子,利用RNAi技术敲低HPGD的表达,发现肝癌细胞发生凋亡。此外,2DE和DIGE结果中均发现“多点一蛋白”现象,提示翻译后修饰作用在蛋白质中广泛存在。第三部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的系统生物学研究。利用1DSDS-PAGE-RPLC-LTQ Obitrap技术平台在四个不同转移潜能的肝癌细胞系和Hep3B肝癌细胞系中,一共鉴定到7,034种非冗余的蛋白质。以HLPP数据库中正常人肝组织的蛋白质组学数据为对照,发现增殖能力的增强与肝癌的发生相关,而抗凋亡能力的增强促进肝癌细胞的转移。与转录组芯片数据的对接发现,转录组与蛋白质组的表达量水平没有相关性,但有意义的发现是TAPE值与蛋白质的亚细胞定位存在密切的联系,TAPE值偏低的蛋白质聚集于细胞核和细胞外分泌蛋白质,而TAPE值偏高的蛋白质主要聚集于细胞浆中。第四部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的分泌蛋白组学研究。本部分研究中结合iTRAQ定量标记技术发展了一种新方法,有效地抵消了细胞破碎等污染对分泌蛋白质研究的干扰。分泌蛋白质组检测出低丰度的SDC4和ANGPTL4,其表达量与肝癌转移正相关,并发现促肝癌转移的膜蛋白MET也可以通过水解等作用分泌到细胞外,本研究中还发现HSPA5在高低转移细胞系中发生了显著的亚细胞定位变化,这些发现与癌症转移的关系还有待进一步的研究。第五部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的蛋白质翻译后修饰作用研究。结合酶切等生物化学方法和DIGE技术对O型糖基化修饰做了初步研究,发现其是造成弱碱性条件下出现蛋白质串点的主要原因。利用PROTOMAP软件和第三部分的实验结果研究了蛋白质降解谱,发现部分溶酶体和细胞膜的蛋白质通过降解作用获得活性,如HEXB、ASAH1和MET等,这些蛋白质的功能集中于水解作用和细胞粘附。在MEROPS蛋白酶数据库中找到作用于这些蛋白质的MMPs和caspase等在肝癌转移过程中发挥重要作用的蛋白酶。第六部分：磁性材料富集血清中低丰度蛋白的应用研究。本部分研究建立了酰肼基团修饰的磁珠材料富集色氨酸肽段的方法,并首次对血清中的色氨酸肽段进行了富集,样本中的色氨酸肽段含量从富集前的19.4%提高到80.2%。本方法有效地降低了血清样品的复杂度,在富集后的血清样品中新鉴定到113个色氨酸肽段和37个含有色氨酸的蛋白质。