研究背景和目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是以黑质致密部(substantia nigra compacta,SNc)多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元变性为特征的神经退行性疾病,主要临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等躯体运动障碍,以及抑郁、认识障碍等非运动症状,并且病情呈进行性加重,严重影响患者的生活质量和社会功能。调查显示,在神经退系统退行性疾病中,PD已成为中老年人群中仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的最常见疾病[1]。现有的治疗方法只能部分改善患者的症状,并不能延缓帕金森病病情的进展,深入探索其发病机制和新的治疗方法有着非常重要的意义。虽然帕金森病的确切发病机制目前尚不十分清楚,但是通过研究,一些可能的机制理论被提出,包括:氧化应激、线粒体功能障碍、泛素蛋白酶体系统功能障碍以及神经炎性反应等[2]。而近些年认为,线粒体损伤是的PD较为重要的病理机理。线粒体是一个不断分裂和融合的动态细胞器,它通过调节细胞内钙、细胞凋亡、能量平衡、自由基清除以及一些其他新陈代谢活动来维持神经元的正常功能[3]。线粒体融合和分裂对维持线粒体功能以及细胞的活性有着重要的作用,与线粒体融合相关的重要蛋白是Mfn1、Mfn2和Opa1等,与线粒体分裂相关的重要蛋白是Drp1、Fis1等。尽管线粒体功能损伤是帕金森病发病的关键机制,但是其潜在的分子机制尚不完全清楚,所以,缺乏有效的医疗干预措施。因此,研究引起帕金森病线粒体功能损伤的潜在机制对探索治疗方法有着重要意义。目前,最有效的线粒体靶向的抗氧化剂是MitoQ,它对线粒体的保护作用是辅酶Q的几百倍[4]。研究证实,MitoQ对线粒体氧化应激损伤相关疾病具有保护作用,但它在PD模型的保护作用及具体机制并不完全明确。因此,本实验通过6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导建立体内外PD模型,观察线粒体融合蛋白和分裂蛋白在帕金森病模型中的改变,探索新型线粒体靶向抗氧化药物MitoQ对帕金森病的治疗作用,进一步研究其分子水平通路调节的相关机制。研究方法:本研究离体实验选用小鼠多巴胺能神经元细胞系SN4741细胞系,通过6-OHDA诱导建立PD细胞模型,采用Western blot方法观察PD细胞模型中线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2以及线粒体分裂蛋白Drp1的变化。然后采用MitoQ处理PD细胞模型,观察其对线粒体融合蛋白的作用,并通过转染小干扰RNA(siRNA)、免疫荧光染色以及实时定量PCR等方法明确分子水平调节通路。进一步,通过线粒体染色观察线粒体形态改变,通过JC-1染色和TMRE染色检测线粒体膜电位功能改变,明确MitoQ对PD模型中线粒体保护作用的机制。并采用TUNEL染色以及Western blot观察MitoQ对PD细胞模型抗凋亡的保护作用。最后,通过6-OHDA局部注射C57bl/6小鼠前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)建立PD动物模型,通过TH染色以及Western blot技术进一步探索MitoQ对6-OHDA诱导PD模型中DA神经元的保护作用。研究结果:第一部分:6-OHDA处理对DA神经元中线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和分裂蛋白Drp1表达的作用在SN4741细胞中,给予浓度梯度的6-OHDA处理12 h,Western blot结果显示随着浓度的增加线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达显著降低,线粒体分裂蛋白Drp1表达增加。选择最适合6-OHDA浓度80μM,给予时间梯度的6-OHDA处理,Western blot结果显示随着时间线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达降低,线粒体分裂蛋白Drp1表达增加。以上实验结果表明在DA细胞系SN4741中,6-OHDA降低线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2以及增加线粒体分裂蛋白Drp1的表达。第二部分:MitoQ调控6-OHDA诱导的PD细胞模型线粒体融合的作用及机制(1)不同浓度梯度MitoQ处理SN4741细胞12 h,Western blot结果显示线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2随着浓度增加表达增高,并在50 nM达到峰值。其中Mfn2表达增加趋势最为显著。选择50 nM浓度给予时间梯度处理,Western blot结果显示随着时间的增加线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2表达增高并在12 h达到峰值,Mfn2表达增加趋势最为显著。结果提示Mfn2可能在MitoQ介导的线粒体融合调控中发挥重要的作用。(2)根据上述结果,采用50 nM MitoQ处理细胞12 h,接着给予80μM MitoQ再培养12 h。Western blot结果和免疫荧光染色结果显示MitoQ可以逆转6-OHDA引起线粒体融合蛋白Mfn2表达的降低。进一步,采用MFN2 siRNA转染SN4741细胞24 h后,再采用50 nM MitoQ处理细胞12 h,接着给予80μM 6-OHDA再培养12 h。Western blot结果和免疫荧光染色结果显示,在siRNA转染细胞的对照组MitoQ可以逆转6-OHDA引起线粒体融合蛋白Mfn2表达的降低,而在siMFN2转染处理组,MitoQ的作用被显著减弱。荧光染色显示,与对照组相比,在siMFN2转染细胞中,Mfn2的表达明显降低并伴随明显的线粒体碎裂现象。结果表明MitoQ通过增加Mfn2的表达促进了线粒体的融合,并有可能通过此途径维持线粒体的正常功能。(3)进一步探讨MitoQ上调Mfn2的机制,在SN4741细胞中,给予浓度梯度MitoQ处理12 h,Western blot结果显示,50 nM MitoQ处理组PGC-1α表达明显增加;实时定量PCR结果显示50 nM MitoQ处理组PGC-1α和MFN2的mRNA水平均明显增加。细胞转染siPGC-1α,Western blot结果显示6-OHDA引起明显的PGC1-α和Mfn2表达水平降低;MitoQ可以明显提高降低的PGC1-α和Mfn2的表达,但是在siPGC-1α转染组MitoQ对PGC1-α和Mfn2的作用被阻断。上述结果提示,MitoQ可能通过上调PGC-1α的表达促进了Mfn2的表达。第三部分:MitoQ对6-OHDA诱导的PD细胞和动物模型DA神经元线粒体形态和功能及细胞存活的保护作用(1)通过Mito-red染色标记DA神经元线粒体形态,结果显示6-OHDA处理引起明显的线粒体形态损害,而MitoQ能够显著稳定线粒体形态,减少线粒体碎片的形成。JC-1和TMRE染色结果表明MitoQ可以减轻6-OHDA引起的线粒体膜电位降低。CellROX染色结果显示MitoQ可以减少6-OHDA诱导的ROS生成。(2)TUNEL染色和Western blot结果显示MitoQ可以减轻6-OHDA引起的神经元凋亡。转染siMFN2于6-OHDA处理细胞模型,可以发现上调的cleaved caspase-3表达量相比对照组进一步增加,而MitoQ处理并不能抑制cleaved caspase-3的表达增加。因此,以上实验结果表明MitoQ可能通过Mfn2抑制6-OHDA引起的神经元细胞凋亡。(3)在体实验:提前给予在体小鼠MitoQ处理3天后,6-OHDA立体定向注射小鼠右侧MFB建立PD动物模型后继续MitoQ处理持续至14天。Western blot结果显示MitoQ可以上调Mfn2的表达,并逆转6-OHDA引起的Mfn2表达降低。免疫荧光染色结果显示MitoQ可以抑制6-OHDA引起的TH染色阳性DA神经元减少。以上实验结果明确了MitoQ在PD动物模型中对神经元的保护作用。研究结论:本实验确定了MitoQ通过减轻线粒体损伤对6-OHDA诱导PD模型中的DA神经元产生保护作用。并发现MitoQ可以通过激活PGC1-α增加Mfn2的表达来调节线粒体的融合,从而对抗6-OHDA引起的改变。这些结果可能为包括PD在内的线粒体功能受损相关神经退行性疾病提供了新的治疗思路。