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目的本课题筛选获得高沉默效率的酪氨酸磷酸酶sigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma, PTPσ)特异性小干扰RNA (small interference RNA, siRNA),应用第三代慢病毒载体系统将其导入原代培养大鼠大脑皮层神经元及脊髓损伤局部,阻断硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs)受体PTPσ的表达,消除CSPGs对轴突再生的抑制作用,观察PTPσ基因沉默对神经元轴突再生及脊髓损伤后神经功能的修复效果。方法1. siRNA在线设计工具siRNA Wizard设计5条针对PTPσ基因编码序列(coding sequence, CDS)的siRNA,通过双质粒转染增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告系统初步检测其抑制效率。选取最高抑制效率siRNA,构建第三代慢病毒载体,并用其将高抑制活性siRNA导入原代培养神经元及脊髓损伤局部,qRT-PCR及Western blot技术检测PTPσ基因沉默的精确效率。2. Wistar大鼠大脑皮层神经元原代培养,并将其接种于包被多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL). CSPGs及层粘连蛋白(laminin, LN)的玻片,高抑制活性PTPa特异性siRNA慢病毒载体感染神经元,感染后4天免疫细胞化学染色标记神经元轴突及CSPGs,并利用Image-Pro Plus 6.0软件测量神经元轴突长度、数量及穿越CSPGs的百分比,探索PTPa沉默神经元在CSPGs基质上的再生及穿越能力。3.体内实验采用10周龄雌性Wistar大鼠,利用NYU Impactor Model-Ⅱ打击器制备脊髓胸10(T10)损伤模型。随机分为四组：对照组(DMEM)、 PTPσ-control组、PTPσ-scrambled (PTPσ-scr)组、PTPσ-RNAi组,造模后立即行各组相应的局部注射。局部注射后1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w行大鼠后肢功能行为学评分(BBB评分),并于6w行大鼠脚印学分析,以观察大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。局部注射6w后行体感诱发电位(Somatosensory evoked potentials, SSEPs)检测,以评估脊髓损伤后感觉功能修复。局部注射后6w行冰冻切片免疫荧光组织化学检测神经丝蛋白(Neurofilament protein 200, NF-200)、突触素(synaptophysin)及胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein, GFAP),以观察脊髓损伤局部轴突再生、突触形成及胶质瘢痕形成情况。结果1. PTPσ-siRNA慢病毒载体成功感染大鼠大脑皮层神经元细胞,并能有效沉默PTPσ基因mRNA (p<0.001)及蛋白质(p<0.001)的表达；脊髓损伤局部注射PTPσ-siRNA漫病毒载体亦可以有效沉默PTPσ基因mRNA (p<0.001)及蛋白质(p<0.001)的表达。2.在CSPGs基质上,PTPσ-RNAi组神经元轴突再生长度明显较长,且差异具有统计学意义(p<0.001);同时,PTPσ-RNAi组神经元轴突表现出更强的穿越CSPGs的能力,且差异具有统计学意义(p<0.001)。3.脊髓损伤后6w行免疫组织化学染色。NF 200染色结果表明,PTPσ-RNAi组脊髓损伤周围轴突再生明显增强,差异具有统计学意义(p<0.001)；突触素染色结果显示,PTPσ-RNAi组脊髓损伤周围突触形成明显增强,差异具有统计学意义(p<0.001)；而GFAP染色结果显示,各组胶质瘢痕形成并无统计学差异(p>0.05)。4. 脊髓损伤后1d、1w各组间大鼠BBB评分差异无统计学意义(p>0.05),损伤后2w起各时间点评分PTPσ-RNAi组均明显优于其他各组(p<0.001)；脊髓损伤后6w脚印学分析显示,PTPσ-RNAi组大鼠在步长(p<0.001)、后肢旋转角度(p<0.001)及后足间距离(p<0.001)均呈现有意义的改善；6w体感诱发电位检测显示,PTPσ-RNAi组体感诱发电位P1及N1波的潜伏期明显缩短(p<0.001),波幅明显增大(p<0.001)。结论慢病毒介导的siRNA能有效感染大鼠大脑皮层神经元,并能沉默PTPσ基因表达,有效减轻CSPGs的轴突抑制作用；同时,局部注射PTPσ-RNAi慢病毒载体可有效促进脊髓损伤后运动和感觉功能的恢复,免疫组织化学染色亦显示增强的轴突再生及突触形成,而不加重胶质瘢痕的形成。课题为PTPσ-RNAi修复脊髓损伤提供了理论基础和实验依据。