金属植入材料因其具有良好的生物相容性、综合力学性能以及优良的机械加工性能,已被广泛应用于骨科、齿科内固定植入材料及假体的制造。但是,相关统计研究数据表明,第一次全髋关节置换术后的感染发生率在0.5%到3.0%之间,而肿瘤假体材料植入术后的感染率更是高达5%到35%。因此,怎样降低或者避免这类假体植入术后感染的发生已经成为医疗领域面临和亟待解决的重大难点问题。金属离子具有良好的抗菌效能,因此通过在金属植入材料中适量加入具有抗菌作用的金属元素(如镁、银、铜、锌等金属元素),在不损害原金属材料的理化性能的基础上,开发出具有抗菌特性的金属植入假体材料,已经成为新型材料开发领域中的一个热门方法。本课题以通过在临床常用的钛合金Ti6Al4V中添加Cu元素而开发出具有抗菌活性的新型钛合金Ti6Al4V5Cu为研究对象,采用医学与材料学相结合的研究方式,从分子、细胞水平上系统研究该新型抗菌钛合金对成骨细胞粘附、增长、分化、成熟等方面的影响,以及材料对血细胞及血小板的作用情况,从而深入评价其生物安全性,并进一步深入探讨其促成骨作用与抗菌性能的相互关系,以期为新型抗菌钛合金新材料的研究与发展以及进一步的临床应用提供科学依据。研究目的:拟通过在临床常用钛合金Ti6Al4V中添加Cu元素而开发出新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu为研究对象,采用细胞与材料共培养的研究方法,从分子、细胞水平上系统研究该新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu的血液相容性、细胞相容性以及其促成骨的性能,为抗菌钛合金新材料的研发与生物医学相关应用提供科学依据。研究材料与方法:以新开发的新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu为研究对象,以目前临床广泛应用的植入钛合金Ti6Al4V为阴性对照组,以纯铜Cu为阳性对照组。选用美国ATCC购买的小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)为实验研究细胞。利用材料与细胞共培养的方法,通过对共培养细胞的毒性检测、材料与细胞、血小板的粘附实验、材料表面细胞Live/Dead染色观察、材料表面早期粘附细胞的DAPI染色观察、以及材料表面粘附细胞的骨架染色观察、材料的急性溶血性实验、材料蛋白粘附检测等实验对新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu的血液相容性、细胞相容性做系统的研究;通过材料与细胞的共培养,在不同培养时间点做细胞内的碱性磷酸酶相对含量检测、细胞外矿化基质茜素红染色观测、以及通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测细胞内成骨相关基因的相对表达情况等,从而对新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu的促成骨性能做深入研究。实验结果:(1)通过MTT实验证实随着培养时间延长各实验组细胞活力增加;Ti6Al4V5Cu材料组、Ti6Al4V材料、阴性对照组之间细胞增殖活力未表现出明显差异(P>0.05);(2)通过细胞黏附实验发现,MC3T3-E1细胞在Ti6Al4V5Cu材料及Ti6Al4V材料表面都能很好的黏附,细胞铺展均匀,伪足伸展;(3)通过材料与培养基的共培养,发现蛋白质在Ti6Al4V5Cu材料表面的黏附的数量较在Ti6Al4V材料表面粘附多,且差别有统计学意义(P<0.01);(4)DAPI染色定量计数发现,随着时间延长,细胞早期在Ti6Al4V5Cu、Ti6Al4V两组材料表面的粘附数量逐渐增多;纯Cu组因铜离子的释放,材料表现出一定的细胞毒性,所以随着时间的延长细胞在其表面粘附的数量越少。在90min时,细胞在Ti6Al4V5Cu材料表面的粘附数量明显多于细胞在Ti6Al4V材料表面的粘附数量,且差别具有统计学差异(P<0.01);(5)Live/Dead染色观察,Ti6Al4V5Cu材料组、Ti6Al4V材料组均未见明显的死细胞存在,Ti6Al4V5Cu材料未表现出明显的细胞毒性;(6)细胞骨架三色染色法观察细胞形貌,MC3T3-E1细胞在Ti6Al4V5Cu表面伪足伸展均匀,细胞骨架形态完整饱满,细胞内肌动肌丝蛋白数量丰富;(7)Ti6Al4V材料组急性溶血率2.1%,Ti6Al4V5Cu材料组急性溶血率为0.3%,两组材料溶血率均<5%,符合植入材料血液相容性标准;(8)通过扫描电镜观察血小板在Ti6Al4V5Cu材料表面黏附情况,发现血小板在Ti6Al4V5Cu材料表面黏附数量少,形态正常,无伪足伸出,无血小板聚集等凝血表现,说明Ti6Al4V5Cu不具有促进血小板聚集凝血的作用;(9)材料与细胞共培养以后,于培养第7、14、21天检测细胞中ALP相对含量,发现ALP在细胞中的相对含量在培养早期开始升高,后期慢慢下降;在第7天,Ti6Al4V5Cu材料组细胞中ALP相对含量明显高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.01);在第14天两组未见明显差异,至第21天时,Ti6Al4V5Cu材料组细胞中ALP相对含量低于对照组(P<0.01);(10)细胞外矿化基质染色,发现试验组与对照组两组均在第十四天可见细胞外矿化结节形成,但两组间未见明显差异(P>0.05);至第28天可见细胞外大量矿化结节形成,经定量分析发现Ti6Al4V5Cu材料组细胞外矿化基质含量明显高于对照Ti6Al4V材料组,且差别有统计学意义(P<0.01);(11)细胞与材料共培养7、14、21天,通过QT-PCR检测成骨相关基因:ALP,BMP-2,COL-I,OPN,OST,OCN,RUNX-2的相对表达量的变化。ALP、OPN基因在细胞与材料共培养的早期既明显升高,随后逐渐降低;Ti6Al4V5Cu材料组与Ti6Al4V材料组相比,ALP、OPN在Ti6Al4V5Cu材料组早期(7d、14d)升高更加明显,且差别具有统计学差异(P<0.01);BMP-2基因在两组材料细胞中表达量随时间延长而表达增加,但在两组之间表达量差异无统计学差异(P>0.05)。COL-Ⅰ、OCN基因在两组细胞中的表达量随着培养时间延长而增加;两组相比,OCN基因在Ti6Al4V5Cu材料组第14d、21d的相对表达量较Ti6Al4V材料组高,且差异具有显著性(P<0.01)。OST、RUNX-2基因在两组细胞增殖、分化过程中都有很高的表达,Ti6Al4V5Cu材料组细胞在第14d时OST基因的表达和第21d时RUN X-2基因的表达量明显高于Ti6Al4V材料组,且差异具有显著性差异(P<0.01)。结论(1)通过急性溶血实验、血小板黏附实验,我们发现Ti6Al4V5Cu材料溶血率为0.3%,远低于植入物溶血率最低要求5%。且通过SEM,我们从形态上进一步的证明,血小板在材料的表面黏附很少,且无血小板聚集现象,充分证明新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu具有良好的血液相容性。(2)通过材料与小鼠前成骨细胞的共培养,MTT法检测细胞活力;通过SME扫描从直观上观察细胞在材料表面的黏附、伸展,生长良好;以及对与材料共培养细胞的死活细胞数进行染色观察,对生长细胞的完整性及细胞内部结构的染色观察。证实小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞在新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu表面生长良好。说明Ti6Al4V5Cu钛合金具有良好的细胞相容性。(3)通过材料与小鼠前成骨细胞共培养,通过对细胞增殖、分化、成熟过程中ALP的检测及细胞外矿化基质的检测,以及实时定量PCR对成骨相关基因表达的研究,发现新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu具有促进小鼠前成骨细胞成熟分化的作用。综上,新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu具有良好的细胞相容性和血液相容性,且具有良好的生物学性能,一方面其表面具有良好的蛋白粘附性能,能很好的促进成骨细胞在其表面粘附生长增殖及分化,增加了其作为植入材料与宿主之间的适配性,减少了细菌在其表面形成生物膜的可能。另一方便,新型抗菌钛合金Ti6Al4V5Cu通过其自身所含的铜元素源源不断的释放出铜离子,铜离子不仅具有抗菌杀菌的作用,同时也具有促进成骨细胞成骨分化的作用。