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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指无长期大量酒精损伤以及其他明确的肝损伤因素所致的脂肪过度沉积于肝细胞内为主要特征的临床病理综合征,临床上以肝脂肪变和NASH最为常见。NAFLD以其潜在危害性及累及多脏器、持续发展的特点越来越多地受到相关专业人士的重视。NAFLD形成的先决条件是肝细胞脂质沉积。mTORC1/SREBP-lc信号通路是调节细胞脂质代谢的关键途径,我们前期通过体内外实验证实根皮苷能够显著抑制肝细胞的脂肪变性及脂质合成,其作用机制与抑制mTOR、SREBPs蛋白的活化有关。基于此,本项目课题进一步提出“根皮苷通过调控mTORCl/SREBP-lc信号通路活性,抑制肝细胞脂质沉积,从而阻制NAFLD的发生发展”的科学假说,研究根皮苷干预aP2-SREBFlc转基因小鼠及脂变L02细胞后的影响及其作用机制,为防治非酒精性脂肪肝提供可靠的实验依据。目的：本研究首先在体外通过体外L02人肝细胞脂变模型,以mTOR抑制剂及激活剂为工具药,另外以mTOR下游蛋白SREBP转染慢病毒为媒介,对根皮苷干预L02肝细胞的作用机制进行初步探讨。确定在L02细胞中根皮苷抑制肝细胞脂质沉积是否是通过调节mTORC1、SREBP-lc这两个蛋白的表达来进行调控。然后,再用Western blot法,检测肝细胞中mTORC1/SREBP-lc信号通路相关的蛋白(p38MAPK、p-p38MAPK、mTOR、 p-mTOR、GβL、Raptor、SREBP-lc、FAS)的表达来探讨这一猜想。随后,采用根皮苷对aP2-SREBF1c原发性非酒精性脂肪肝转基因小鼠进行干预,进一步考察根皮苷能否扭转SREBFlc过表达小鼠体内的SREBFlc蛋白水平,进而改善脂代谢。最后,进一步探讨根皮苷对ap2-SREBP-lc小鼠肝脏组织中mTOR1C/SREBP-lc通路调节的机制进行。从体外细胞及在体动物实验两个角度考察根皮苷对NAFLD的影响及其作用机制。方法：一、L02人肝细胞实验部分(一)采用油酸诱导L02肝细胞发生脂肪变性后,以mTOR抑制剂为工具药,同时,给药不同浓度剂量根皮苷干预。观察其脂滴数量、油红0染色、细胞内TG、TC、AST、 ALT指标。(二)采用油酸诱导L02肝细胞发生脂肪变性后,以mTOR激活剂为工具药,同时,给药不同浓度剂量根皮苷干预。观察其脂滴数量、油红0染色、细胞内TG、TC、AST、 ALT指标。(三)观察根皮苷对EF1A-SREBP-IRES-eGFP过表达慢病毒转染L02细胞中mTOR、 SREBP-1c、FAS mRNA水平的影响二、根皮苷干预L02人肝细胞作用机制研究western blot方法检测脂变模型L02肝细胞及根皮苷干预后的细胞的mTORCl/SREBP-1c信号通路的上下游蛋白的表达,包括p38MAPK、mTOR.SREBP-1c、 FAS和其磷酸化蛋白等蛋白。三.aP2-SREBF1c原发性非酒精性脂肪肝转基因小鼠模型动物实验aP2-SREBF1c转基因小鼠,雌性,9周龄,高甘油三酯饲料。实验分组为：野生型对照组,aP2-SREBF1c转基因小鼠模型组,辛伐他汀组,60mg/kg根皮苷组、120mg/kg根皮苷组,连续给药20周。检测指标包括：(1)一般指标：体重、摄食量、脏器系数。(2)糖脂代谢指标：空腹血糖、胰岛素耐量、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、游离脂肪酸、胰岛素、口服葡萄糖耐量。(3)组织病理观察：肝脏组织。四、采用Western blot法检测aP2-SREBFlc转基因小鼠肝脏组织中mTORC1/SREBP-1c信号通路的上下游蛋白的表达。结果：一、根皮苷对脂变L02肝细胞的作用。根皮苷干预肝细胞脂变后,给药组油红0染色的OD值以及TC.TG.AST.ALT水平均明显比模型组降低(P<0.05或P<0.01)。雷帕霉素与各剂量根皮苷联用给药干预后,油红染色OD值下降,但各剂量下降幅度与根皮苷高剂量单独给药组比较下降幅度无显著差异。亮氨酸与各剂量根皮苷联用给药干预后,油红染色OD值与模型组相比也下降,但各剂量下降幅度与根皮苷单独给药相应剂量相比较下降幅度较小。根皮苷能有效下调EF1A-SREBP-IRES-eGFP慢病毒转染L02细胞中雷帕霉素及根皮苷高剂量组mTOR以及其下游SREBP-1c、FAS mRNA的表达。二、根皮苷对脂变模型L02肝细胞及根皮苷干预后的细胞的mTORCl／SREBP-1c信号通路的上下游蛋白表达的影响。药物干预治疗后,GβL、Raptor、mTOR1C、p-mTOR1C、SREBP-1c的蛋白表达较模型组明显下降,p38MAPK的蛋白表达较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)三、根皮苷对aP2-SREBF1c原发性非酒精性脂肪肝转基因小鼠的作用。与aP2-SREBF1c原发性非酒精性脂肪肝转基因小鼠模型组相比,辛伐他汀和根皮苷给药组小鼠的体重、空腹血糖、TG.TC.FFA、AST.ALT胰岛素水平低密度脂蛋白值均下降,高密度脂蛋白升高(P<0.05或P<0.01),肝脏组织切片内皮细胞、贮脂细胞之中没有增生,未见明显的脂肪肝,具有保护肝脏,防治脂肪肝的作用。四、根皮苷对aP2-SREBFlc转基因小鼠脂肪组织mTORC1/SREBP-1c信号通路的上下游蛋白表达的影响。药物干预治疗后,GβL、Raptor.mTOR1C、p-mTOR1C、SREBP-lc.FAS的蛋白表达较模型组明显下降,p38MAPK的蛋白表达较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)结论：根皮苷对aP2-SREBFlc原发性非酒精性脂肪肝转基因小鼠的空腹血糖、血脂四项等指标具有调节作用。在体内外实验中均能有效抑制肝细胞脂肪变性、减少细胞中脂质堆积；下调GβL、Raptor、mTORlC、SREBP-lc、FAS等蛋白表达,以及上调p38MAPK的蛋白表达。因此根皮苷可能通过调控mTORCl/SREBP-1c信号通路活性,抑制肝细胞脂质沉积,从而阻制NAFLD的发生发展。